Пробиотики в профилактике гепатоцеллюлярной карциномы при циррозе

Вопрос исследования Предотвращает ли модулирование кишечного микробиома пробиотиками развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени? Целью данного исследования является оценка эффективности пробиотиков в снижении частоты гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени А-В по Чайлд-Пью с портальной гипертензией.

Методы Дизайн исследования. Интервенционное, многоцентровое, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование III фазы.

Следующее исследование будет проведено в соответствии с рекомендациями CONSORT. Сценарий и темпоральность. Исследование будет проводиться в Аргентине, включая центры ухода за пациентами, со следующими критериями включения и исключения, с 1 апреля 2019 г. (этап набора 12 месяцев) до тех пор, пока последний зарегистрированный пациент не завершит наблюдение в течение 3 лет после рандомизации.

Вмешательство. Исследуемый препарат (препараты). И пробиотик, и плацебо будут представлены в одном контейнере, форме и цвете.

Наименование действующего вещества Каждый флакон 50 мл содержит Lactobacillus casei 3,3 x 107 КОЕ/сут, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 КОЕ/сут, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 КОЕ/сут и Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 КОЕ/сут (БИОФЛОРА®, БИОИДУС). ЮАР, Аргентина).

Способ применения: перорально по 5 мл каждые 12 часов в течение 10 последовательных дней в месяц. Продолжительность лечения: 2 цикла непрерывного лечения в год в течение 3 лет (6 циклов). Каждый цикл включает три месяца лечения, за которыми следует трехмесячный перерыв.

Справочное вмешательство. Название действующего вещества: Плацебо. Способ применения: перорально по 5 мл каждые 12 часов в течение 10 последовательных дней в месяц. Продолжительность лечения: 2 цикла непрерывного лечения в год в течение 3 лет (6 циклов). Каждый цикл включает три месяца лечения, за которыми следует трехмесячный перерыв.

** Аналогично, обе группы будут явно требовать воздержания от употребления алкоголя и употребления не гиперкалорийной средиземноморской диеты на протяжении всего исследования для всех пациентов.

Методология. Пациенты, которые соответствуют вышеупомянутым критериям включения и исключения и успешно завершили все скрининговые тесты, будут лечиться стандартными тестами или лечебными препаратами в соответствии с рекомендациями по клинической практике по схеме рандомизации 1:1.

Рандомизация будет стратифицирована по блокам в соответствии с ранее определенными прогностическими переменными и во избежание случайного несбалансированного распределения потенциальных смешанных переменных и/или модификаторов эффекта: показатель B по шкале Чайлд-Пью и количество тромбоцитов <100 000/мм3. Рандомизация будет проводиться в соответствии с назначением с помощью номеров, предварительно сделанных исследователем вслепую и не зависящих от клинических характеристик и контакта с пациентами. Все номера рандомизации будут храниться в закрытых непрозрачных конвертах и ​​будут присваиваться последовательно в соответствии с порядком включения в протокол.

*Все события, разработанные, как первичные, так и вторичные на протяжении всего исследования, будут оцениваться слепым и независимым комитетом на основе исходных переменных и рандомизированного распределения. Клинические события будут контролироваться и переоцениваться этим комитетом, который будет состоять из 3 исследователей.

Переменные экспозиции.

• Клинические данные

• Образцы периферической крови для измерения цитокинов, LPS и экспрессии TLR 4.

  • Цитокины: Измерение цитокинов будет проводиться в плазме образцов периферической крови. Уровни следующих цитокинов будут количественно определены в пг/мл: IL-6, TNF-α и эндотоксемии или бактериального липополисахарида (LPS). Операторы этого измерения будут слепы к любому клиническому, микробиому и назначению лечения. Образцы, которые должны быть получены от каждого человека: две пробирки по 10 мл цельной крови, одна с ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), а другая без антикоагулянта, для использования в рутинных лабораторных исследованиях и измерении цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-альфа) и эндотоксинов ( ЛПС). Количественное определение цитокинов плазмы: Коммерческие реагенты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) будут использоваться для измерения уровней цитокинов, присутствующих в плазме пациентов. Концентрации TNF-альфа и IL-6 будут измеряться с помощью коммерческих реагентов eBioscience, affymetrix или аналогичных коммерческих реагентов, доступных на рынке, в строгом соответствии с инструкциями соответствующих производителей. Для количественного определения цитокинов будут построены кривые с соответствующими стандартами концентрации.
  • Количественное определение эндотоксинов в плазме или сыворотке: Измерение бактериального LPS будет выполняться с помощью Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), хромогенного реагента конечной точки Biosafe Srl или аналогичного, параллельно с кривой концентрации стандартов. Инструкции производителя будут соблюдены.
  • Экспрессия TLR 4 в мононуклеарных клетках периферической крови: экспрессия TLR 4 в мононуклеарных клетках будет количественно оцениваться методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров.

  • Образцы стула для оценки микробиома кишечника.

    1. Метод сбора: Образец самопроизвольного стула будет собираться в любое время суток в прилагаемый коллектор, избегая контакта с материалами, не имеющими запаха. После того, как образец собран, коллектор с соответствующей крышкой помещается в защитный пакет и в коробку с комплектом. Эти образцы будут храниться в замороженном виде при температуре -70º. Каждый образец фекалий должен быть надлежащим образом маркирован. Позже образцы будут разделены на аликвоты для окончательной обработки.
    2. Анализ: Фекальный стул будет собран для анализа микробиома кишечника с использованием метода ПЦР, Ilumina, анализа областей V3-V4 16sRNA в Институте биотехнологии Росарио (INDEAR, Росарио, Аргентина). 16S рибосомная субъединица рРНК будет проанализирована на бактерии, амплифицирована с использованием метода ПЦР (20 циклов), а затем второго раунда амплификации для включения мультиплексных адаптеров (штрих-кодов) (10 циклов). В каждой процедуре будут сделаны два измерения, чтобы избежать смещения информации об усилении. Массовое секвенирование будет проводиться командой Illumina MiSeq из института HERITAS (CIBIC + INDEAR) в режиме 2x300, чтобы в конечном итоге получить как минимум 40 000 последовательностей на человека. Качество необработанных данных будет оцениваться FastQC, а информация о парных концах Illumina будет объединена с использованием PEAR (v0.9.10). Затем показания фильтруются по качеству Q30, а дубликаты и химеры ПЦР удаляются с помощью UCHIME. Отфильтрованные последовательности будут сгруппированы в оперативные таксономические единицы (OTU) с 97-процентным сходством с их собственной стратегией, реализованной в QIIME (v1.91). Операторы этого измерения будут слепы к клиническим, микробиомным и первичным переменным события.
• Следующие измерения будут проводиться каждые 6 месяцев у каждого субъекта, включенного в исследование, до окончания исследования или развития основного события: вес и рост, сопутствующие лекарства, полное физическое обследование, лабораторные анализы, оценка по шкале Чайлд-Пью, УЗИ брюшной полости.
• Продольная выборка кишечного микробиома и цитокинов. Второе измерение цитокинов будет проводиться в сыворотке из образцов периферической крови и кишечного микробиома в образцах кала у всех пациентов, включенных в исследование, в конце первого цикла лечения (3-й месяц с момента рандомизации или 12 недель) и в конце исследования. (последний цикл) с использованием той же методологии, описанной выше.

Приверженность и последующее наблюдение: все пациенты будут продолжать следовать протоколу до развития основного события или до его окончания, завершив последующее наблюдение после рандомизации в течение 3 лет. Будет предпринят ряд мер для усиления приверженности лечению в обеих группах и стратегий, чтобы избежать потери последующего наблюдения. Приверженность к лечению будет определяться в 80% доставленных таблеток для обеих рук.

Расчет размера выборки и статистический анализ: будет взято двустороннее статистическое значение, α или ошибка типа I, равная 5% (значение p <0,05), и мощность или ошибка типа II или β, равная 0,20 (мощность 80%). Риск ГЦК в каждой группе будет сравниваться с использованием регрессионного анализа Кокса с коэффициентами риска (HR) и 95% доверительными интервалами, и будет рассчитано число, необходимое для лечения для предотвращения клинического исхода, выполненное в соответствии с принципом «намерение лечить». . Поскольку кумулятивная заболеваемость ГЦК по предыдущим данным из литературы составляет 1-6% в год, относительное снижение риска развития ГЦК в течение 3-летнего периода в группе вмешательства было оценено как клинически значимое с относительной разницей в 30%. эквивалентно ЧСС 0,7. Для каждой группы, размер выборки 140 субъектов, с общей популяцией для включения 280 пациентов, расчетное количество первичных событий в 28.

Все статистические анализы будут проводиться с использованием STATA версии 14.0.

Анализ метаданных микробиома. Биоинформатический анализ данных будет проводиться с использованием настроенного конвейера QIIME. Для оценки дифференциальной численности между группами мы используем пакет DESeq2.