Probiootit hepatosellulaarisen karsinooman ehkäisyssä kirroosissa

Tutkimuskysymys Estääkö suoliston mikrobiomin moduloiminen probiooteilla hepatosellulaarisen karsinooman kehittymistä kirroosipotilailla? Tämän tutkimuksen tavoitteena on arvioida probioottien tehoa hepatosellulaarisen karsinooman ilmaantuvuuden vähentämisessä potilailla, joilla on Child Pugh A-B kirroosi ja portaalihypertensio.

Menetelmät Tutkimussuunnittelu. Vaiheen III interventiotutkimus, monikeskus, satunnaistettu, kaksoissokkoutettu, lumekontrolloitu tutkimus.

Seuraava tutkimus tehdään CONSORTin ohjeiden mukaisesti. Skenaario ja ajallisuus. Tutkimusta kehitetään Argentiinassa, mukaan lukien potilaiden hoitokeskukset seuraavilla sisällyttämis- ja poissulkemiskriteereillä 1.4.2019 alkaen (12 kuukauden rekrytointivaihe) siihen asti, kunnes viimeinen potilas on suorittanut kolmen vuoden seurannan satunnaistamisesta.

Interventio. Testilääkkeet. Sekä probiootti että lumelääke esitetään samassa astiassa, samassa muodossa ja värissä.

Vaikuttavan aineen nimi Jokainen 50 ml:n pullo sisältää Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU / vrk, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU / vrk, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU / vrk ja Bifidobacterium brevis 1,0 x 106OFBIUSLOFU® / vrk SA, Argentiina).

Antotapa: Suun kautta 5 ml suun kautta 12 tunnin välein 10 peräkkäisenä päivänä kuukaudessa. Hoidon kesto: 2 jatkuvaa hoitojaksoa vuodessa 3 vuoden aikana (6 sykliä). Jokainen sykli sisältää kolme kuukautta hoitoa, jota seuraa kolmen kuukauden tauko.

Viiteinterventio. Vaikuttavan aineen nimi: Placebo. Antotapa: Suun kautta 5 ml suun kautta 12 tunnin välein 10 peräkkäisenä päivänä kuukaudessa. Hoidon kesto: 2 jatkuvaa hoitojaksoa vuodessa 3 vuoden aikana (6 sykliä). Jokainen sykli sisältää kolme kuukautta hoitoa, jota seuraa kolmen kuukauden tauko.

** Samoin molemmat haarat pyytävät nimenomaisesti olemaan juomatta alkoholia ja noudattamaan ei-hyperkalorista Välimeren ruokavaliota koko tutkimuksen ajan kaikille potilaille.

Metodologia. Potilaita, jotka täyttävät edellä mainitut sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit ja jotka ovat läpäisseet kaikki seulontatestit, hoidetaan tavanomaisella testi- tai hoitolääkkeellä kliinisen käytännön ohjeiden mukaisesti 1:1-satunnaistusmenetelmällä.

Satunnaistaminen ositetaan lohkoissa aiemmin tunnistettujen ennustemuuttujien mukaisesti ja jotta vältetään mahdolliset hämmentävät muuttujat ja/tai vaikutusmuuntimet, jotka jakautuvat sattumalta epätasapainoisesti: Child Pugh -pistemäärä B ja verihiutaleiden määrä <100 000/mm3. Satunnaistaminen suoritetaan toimeksiannon mukaisesti sokean tutkijan aiemmin tekemien numeroiden avulla, jotka riippuvat kliinisistä ominaisuuksista ja kontakteista potilaiden kanssa. Kaikki satunnaistuksen numerot tallennetaan suljettuihin läpinäkymättömiin kirjekuoriin ja ne määrätään peräkkäin protokollaan sisällyttämisjärjestyksen mukaisesti.

*Sokkoutettu ja riippumaton komitea arvioi kaikki tutkimuksen aikana kehitetyt tapahtumat, sekä primaariset että toissijaiset, perustason muuttujien ja satunnaistuksen perusteella. Tämä 3 tutkijasta koostuva komitea seuraa kliinisiä tapahtumia ja arvioi niitä uudelleen.

Valotusmuuttujat.

• Kliiniset tiedot

• Perifeeriset verinäytteet sytokiinien, LPS:n ja TLR 4:n ilmentymisen mittaamiseen.

  • Sytokiinit: Sytokiinien mittaus tehdään ääreisverinäytteiden plasmasta. Seuraavien sytokiinien tasot määritetään pg/ml:nä: IL-6, TNF-a ja endotoksemia tai bakteerien lipopolysakkaridi (LPS). Tämän mittauksen käyttäjät ovat sokeita kliinisille, mikrobiomi- ja hoitokohdille. Jokaiselta yksilöltä otettavat näytteet: kaksi 10 ml:n kokoveriputkea, joista toisessa on EDTA:ta (natriumetyleenidiamiinitetraasetaattia) ja toisessa ei ole antikoagulanttia, käytettäväksi rutiinilaboratoriotutkimuksissa sekä sytokiinien (IL6 ja TNF-alfa) ja endotoksiinien mittaamisessa ( LPS). Plasman sytokiinien kvantifiointi: Potilaiden plasmassa olevien sytokiinien pitoisuuksien mittaamiseen käytetään kaupallisia entsyymi-immunosorbenttimäärityksen (ELISA) reagensseja. TNF-alfan ja IL-6:n pitoisuudet mitataan kaupallisilla eBioscience-, affymetrix- tai vastaavilla markkinoilla olevilla kaupallisilla reagensseilla noudattaen tarkasti vastaavien valmistajien ohjeita. Sytokiinien kvantifiointia varten käyrät tehdään vastaavilla pitoisuusstandardeilla.
  • Endotoksiinien kvantifiointi plasmassa tai seerumissa: Bakteerien LPS:n mittaus suoritetaan Limulus Amebocyte Lysate Assaylla (LAL), Biosafe Srl:n kromogeenisellä päätepistereagenssilla tai vastaavalla, rinnakkain standardien pitoisuuskäyrän kanssa. Valmistajan ohjeita noudatetaan.
  • TLR 4:n ilmentyminen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa: TLR 4:n ilmentyminen yksitumaisissa soluissa määritetään reaaliaikaisella PCR-tekniikalla käyttämällä erityisiä alukkeita.

  • Ulostenäytteet suoliston mikrobiomin arviointiin.

    1. Keräysmenetelmä: Näyte spontaanista ulosteesta otetaan milloin tahansa vuorokauden aikana mukana toimitettuun jakoputkeen välttäen kosketusta wc-/hajuttomien materiaalien kanssa. Kun näyte on kerätty, asianmukaisesti päällystetty keräin sijoitetaan turvapussiin ja pakkauslaatikon sisään. Nämä näytteet säilytetään pakastettuna -70 asteessa. Jokainen ulostenäyte on merkittävä asianmukaisesti. Myöhemmin näytteet jaetaan eriin lopullista käsittelyä varten.
    2. Analyysi: Uloste kerätään suoliston mikrobiomin analysoimiseksi käyttämällä PCR-tekniikkaa, Iluminaa, analysoimalla 16sRNA:n V3-V4-alueita Rosarion bioteknologiainstituutissa (INDEAR, Rosario, Argentiina). rRNA:n 16S ribosomaalista alayksikköä analysoidaan bakteerisesti, monistetaan käyttämällä PCR-menetelmää (20 sykliä) ja sitten toinen monistuskierros multipleksisovittimien (viivakoodien) sisällyttämiseksi (10 sykliä). Jokaisessa menettelyssä tehdään kaksi mittausta vahvistusinformaation vääristymien välttämiseksi. Massiivinen sekvensointi suoritetaan Illumina MiSeq -tiimillä HERITAS-instituutista (CIBIC + INDEAR) 2x300-tilassa, jotta lopulta saadaan vähintään 40 000 sekvenssiä per henkilö. Raakadatan laadun arvioi FastQC ja Illuminan parien päiden tiedot yhdistetään PEARilla (v0.9.10). Sitten lukemat suodatetaan Q30-laadulla ja kaksoiskappaleet ja PCR-kimeerat eliminoidaan UCHIME:n avulla. Suodatetut sekvenssit ryhmitellään operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) 97 %:n samankaltaisuuteen QIIME:ssä (v1.91) toteutetun oman strategiansa kanssa. Tämän mittauksen käyttäjät ovat sokeita kliinisille, mikrobiomi- ja ensisijaisille tapahtumamuuttujille.
• Seuraavat mittaukset suoritetaan kuuden kuukauden välein jokaiselle ilmoittautuneelle tutkimuksen loppuun tai ensisijaisen tapahtuman kehittymiseen asti: paino ja pituus, samanaikainen lääkitys, täydellinen fyysinen tutkimus, laboratoriokokeet, Child Pugh -pistemäärä, vatsan ultraääni.
• Suoliston mikrobiomin ja sytokiinien pituussuuntainen näytteenotto. Toinen sytokiinimittaus tehdään ääreisveren seerumista ja suoliston mikrobiominäytteistä ulostenäytteissä kaikille tutkimukseen osallistuneille potilaille ensimmäisen hoitosyklin lopussa (3. kuukausi satunnaistamisen jälkeen tai 12 viikkoa) ja tutkimuksen lopussa. (viimeinen sykli) käyttäen samaa edellä kuvattua menetelmää.

Sitoutuminen ja seuranta: Kaikki potilaat jatkavat protokollaa ensisijaisen tapahtuman kehittymiseen saakka tai sen loppuun saakka, kun satunnaistuksen jälkeinen kolmen vuoden seuranta on suoritettu. Useita toimenpiteitä toteutetaan tehostaakseen hoitoon sitoutumista molemmissa käsissä ja strategioissa, jotta vältetään seurannan menettäminen. Hoidon noudattaminen määräytyy 80 %:ssa molempiin käsivarsiin toimitetuista tableteista.

Otoskoon laskeminen ja tilastollinen analyysi: Otetaan kaksisuuntainen tilastollinen arvo, α tai tyypin I virhe 5 % (p-arvo <0,05) ja teho tai virhetyyppi II tai β 0,20 (teho 80 %). HCC-riskiä kussakin haarassa verrataan Cox-regressioanalyysillä riskisuhteilla (HR) ja 95 %:n luottamusvälillä, ja hoitoon tarvittava määrä kliinisen lopputuloksen estämiseksi lasketaan hoidon tarkoitus -periaatteen mukaisesti. . Koska HCC:n kumulatiivinen ilmaantuvuus aikaisempien kirjallisuuden tietojen mukaan on 1-6 % vuodessa, HCC:n kehittymisen suhteellinen riskin pieneneminen kolmen vuoden aikana interventiohaarassa arvioitiin kliinisesti merkitykselliseksi 30 %:n suhteellisella erolla. vastaa HR:ää 0,7. Kussakin haarassa 140 koehenkilön otoskoko, yhteensä 280 potilasta, arvioitu ensisijaisten tapahtumien määrä 28:lla.

Kaikki tilastolliset analyysit suoritetaan STATA-versiolla 14.0.

Mikrobiomin metatietojen analyysi. Tietojen bioinformaattinen analyysi tehdään räätälöidyn QIIME-putkilinjan avulla. Ryhmien välisen runsauden eron arvioimiseen käytämme DESeq2-pakettia.