간경화에서 간세포 암종 예방을 위한 프로바이오틱스

연구 질문 프로바이오틱스로 장내 마이크로바이옴을 조절하면 간경화 환자의 간세포 암종 발병을 예방할 수 있습니까? 이 연구의 목적은 문맥압항진증을 동반한 Child Pugh A-B 간경변증 환자의 간세포 암종 발병률을 감소시키는 프로바이오틱스의 효능을 평가하는 것입니다.

방법 연구 디자인. 3상 중재, 다기관, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조 시험.

다음 연구는 CONSORT 지침에 따라 수행됩니다. 시나리오와 시간성. 이 연구는 2019년 4월 1일(모집 단계 12개월)부터 마지막으로 등록된 환자가 무작위화로부터 3년의 추적 조사를 완료할 때까지 다음의 포함 및 제외 기준을 가진 환자 관리 센터를 포함하여 아르헨티나에서 개발될 것입니다.

간섭. 테스트 약물(들). 프로바이오틱스와 플라시보 모두 동일한 용기, 모양 및 색상으로 제공됩니다.

활성 물질의 이름 각 50ml 병에는 Lactobacillus casei 3.3 x 107 CFU/일, Lactobacillus plantarum 3.3 x 107 CFU/일, Streptococcus faecalis 3.3 x 107 CFU/일 및 Bifidobacterium brevis 1.0 x 106 CFU/일(BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, 아르헨티나) .

투여방법 : 5ml씩 12시간마다 1개월 연속 10일 경구투여. 치료 기간: 3년 동안 1년에 2주기 연속 치료(6주기). 각 주기는 3개월의 치료 후 3개월의 휴지기를 포함합니다.

참조 개입. 활성 물질의 이름: 위약. 투여방법 : 5ml씩 12시간마다 1개월 연속 10일 경구투여. 치료 기간: 3년 동안 1년에 2주기 연속 치료(6주기). 각 주기는 3개월의 치료 후 3개월의 휴지기를 포함합니다.

**마찬가지로 양 팔은 모든 환자에 대해 연구 기간 동안 알코올 비섭취와 비고칼로리 지중해 식단의 섭취를 명시적으로 요청할 것입니다.

방법론. 앞서 언급한 포함 및 제외 기준을 충족하고 모든 선별 검사를 성공적으로 완료한 환자는 1:1 무작위배정 방식을 통해 임상 진료 지침에 따라 표준 검사 또는 치료 약물로 치료받게 됩니다.

무작위화는 이전에 식별된 예후 변수에 따라 그리고 잠재적 혼란 변수 및/또는 불균형 방식으로 우연히 분포된 효과 수정자를 피하기 위해 블록으로 계층화됩니다: Child Pugh 점수 B 및 혈소판 수 <100,000/mm3. 무작위화는 임상적 특징 및 환자와의 접촉과 무관하게 맹검 연구자가 이전에 만든 숫자를 통해 할당에 따라 수행됩니다. 무작위화의 모든 번호는 닫힌 불투명 봉투에 저장되며 프로토콜에 포함된 순서에 따라 연속적으로 할당됩니다.

* 연구 전반에 걸쳐 1차 및 2차 모두에서 개발된 모든 이벤트는 기본 변수 및 무작위 할당에서 눈가림 및 독립 위원회에 의해 평가됩니다. 3명의 조사관으로 구성된 이 위원회에서 임상 이벤트를 모니터링하고 재평가할 것입니다.

노출 변수.

• 임상 데이터

• 사이토카인, LPS 및 TLR 4의 발현 측정을 위한 말초 혈액 샘플.

  • 사이토카인: 사이토카인 측정은 말초 혈액 샘플의 혈장에서 이루어집니다. 다음 사이토카인의 수준은 pg/ml로 정량화됩니다: IL-6, TNF-α 및 내독소혈증 또는 세균성 지질다당류(LPS). 이 측정의 운영자는 모든 임상, 미생물 및 치료 할당에 대해 눈이 멀게 됩니다. 각 개인에게서 채취할 샘플: 일상적인 실험실 연구와 사이토카인(IL6 및 TNF 알파) 및 내독소 측정에 사용되는 전혈 10ml 튜브 2개, 하나는 EDTA(나트륨 에틸렌디아민 테트라아세테이트)가 있고 다른 하나는 항응고제가 없습니다. LPS). 혈장 사이토카인의 정량화: ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)의 상용 시약을 사용하여 환자의 혈장에 존재하는 사이토카인 수준을 측정합니다. TNF 알파 및 IL-6의 농도는 eBioscience, affymetrix의 상용 시약 또는 시장에서 구할 수 있는 유사한 상용 시약을 사용하여 해당 제조업체의 지침을 엄격히 따라 측정합니다. 사이토카인의 정량화를 위해 곡선은 해당 농도 표준으로 만들어집니다.
  • 혈장 또는 혈청 내 내독소의 정량화: 박테리아 LPS의 측정은 표준 농도 곡선과 병행하여 Limulus Amebocyte Lysate Assay(LAL), Biosafe Srl 발색 종점 시약 또는 이와 유사한 방법으로 수행됩니다. 제조업체의 지침을 따릅니다.
  • 말초 혈액 단핵 세포에서 TLR 4의 발현: 단핵 세포에서 TLR 4의 발현은 특정 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 기술로 정량화됩니다.

  • 장내 미생물 평가를 위한 대변 샘플.

    1. 수집 방법: 화장실/무취 물질과의 접촉을 피하면서 제공된 매니폴드에서 하루 중 언제든지 자연 대변 샘플을 수집합니다. 샘플이 수집되면 적절하게 캡을 씌운 수집기를 안전 가방과 키트 상자 안에 넣습니다. 이 샘플은 -70º에서 냉동 보관됩니다. 각 대변 샘플에는 적절한 라벨이 부착되어 있어야 합니다. 나중에 샘플은 최종 처리를 위해 분주됩니다.
    2. 분석: 로사리오 생명공학 연구소(INDEAR, Rosario, Argentina)에서 16sRNA의 V3-V4 영역을 분석하는 PCR 기술인 일루미나를 사용하여 장내 미생물군집을 분석하기 위해 분변을 수집할 것입니다. rRNA의 16S 리보솜 서브유닛은 PCR 방법(20주기)을 사용하여 증폭한 다음 멀티플렉스 어댑터(바코드)(10주기)를 통합하기 위한 두 번째 증폭 라운드를 사용하여 박테리아로 분석됩니다. 각 절차에서 증폭 정보 편향을 피하기 위해 두 가지 측정이 이루어집니다. 대규모 시퀀싱은 HERITAS 연구소(CIBIC + INDEAR)의 illumina MiSeq 팀에서 2x300 모드로 수행되어 최종적으로 개인당 최소 40,000개의 시퀀스를 얻습니다. 원시 데이터의 품질은 FastQC에서 평가되며 Illumina의 쌍단 정보는 PEAR(v0.9.10)를 사용하여 결합됩니다. 그런 다음 판독값을 Q30 품질로 필터링하고 중복 및 PCR 키메라는 UCHIME를 사용하여 제거합니다. 필터링된 시퀀스는 QIIME(v1.91)에서 구현된 자체 전략과 97% 유사성으로 OTU(Operational Taxonomic Units)에 클러스터링됩니다. 이 측정의 운영자는 임상, 마이크로바이옴 및 주요 이벤트 변수에 대해 눈이 멀 것입니다.
• 다음 측정은 연구가 끝날 때까지 등록된 각 피험자에서 6개월마다 또는 기본 이벤트의 개발이 수행됩니다: 체중 및 키, 병용 약물, 전체 신체 검사, 실험실 테스트, Child Pugh 점수, 복부 초음파.
• 장내 마이크로바이옴 및 사이토카인의 종방향 샘플링. 두 번째 사이토카인 측정은 첫 번째 치료 주기 종료 시(무작위 배정 후 3개월 또는 12주) 연구 종료 시 연구에 포함된 모든 환자의 배설물 샘플에서 말초혈액 및 장내 미생물군집 샘플로 이루어집니다. (마지막 주기) 위에서 설명한 동일한 방법론을 사용합니다.

준수 및 후속 조치: 모든 환자는 1차 사건이 발생할 때까지 또는 3년의 무작위화 후 후속 조치가 완료될 때까지 프로토콜을 계속 유지합니다. 후속 조치의 손실을 피하기 위한 전략과 두 팔의 치료 순응도를 강화하기 위해 몇 가지 조치가 수행될 것입니다. 치료 준수에 대한 순응도는 양쪽 팔에 전달된 정제의 80%에서 정의됩니다.

샘플 크기 계산 및 통계 분석: 양측 통계 값, α 또는 5%의 유형 I 오류(p 값 <0.05) 및 0.20의 검정력 또는 오류 유형 II 또는 β(80%의 검정력)를 취합니다. 각 팔의 HCC 위험은 위험 비율(HR) 및 95% 신뢰 구간을 사용한 Cox 회귀 분석을 사용하여 비교되고 임상 결과를 예방하기 위해 필요한 치료 횟수는 치료 의도 원칙에 따라 계산됩니다. . 문헌의 이전 데이터에서 간세포암종의 누적 발생률이 연간 1-6%이므로 중재군에서 3년 동안 간세포암 발병의 상대적 위험 감소는 30%의 상대적 차이로 임상적으로 관련이 있는 것으로 추정되었습니다. 0.7의 HR에 해당합니다. 각 부문에 대해 140명의 피험자의 표본 크기와 280명의 환자를 등록할 총 모집단, 28개의 주요 사건 수를 추정했습니다.

모든 통계 분석은 STATA 버전 14.0을 사용하여 수행됩니다.

마이크로바이옴 메타데이터 분석. 데이터의 생물 정보 분석은 맞춤형 QIIME 파이프라인을 사용하여 수행됩니다. 그룹 간의 차등 풍부도를 추정하기 위해 DESeq2 패키지를 사용합니다.