Probiotika v prevenci hepatocelulárního karcinomu u cirhózy

Výzkumná otázka Zabraňuje modulace střevního mikrobiomu probiotiky rozvoji hepatocelulárního karcinomu u pacientů s cirhózou? Cílem této studie je zhodnotit účinnost probiotik při snižování výskytu hepatocelulárního karcinomu u pacientů s Child Pugh A-B cirhózou s portální hypertenzí.

Metody Návrh studie. Intervenční, multicentrická, randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná studie fáze III.

Následující studie bude provedena podle pokynů CONSORT. Scénář a dočasnost. Studie bude vyvinuta v Argentině včetně center péče o pacienty s následujícími kritérii pro zařazení a vyloučení od 1. dubna 2019 (fáze náboru v délce 12 měsíců), dokud poslední zařazený pacient nedokončí sledování po dobu 3 let od randomizace.

Zásah. Testované léčivo (látky). Probiotika i placebo budou prezentovány ve stejné nádobě, tvaru a barvě.

Název léčivé látky Každá 50ml lahvička obsahuje Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU/den, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU/den, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU/den a Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CFU/den SA, Argentina).

Způsob podání: Perorálně 5 ml perorálně každých 12 hodin po dobu 10 po sobě jdoucích dnů v měsíci. Délka léčby: 2 cykly kontinuální léčby ročně během 3letého období (6 cyklů). Každý cyklus zahrnuje tři měsíce léčby, po nichž následuje tříměsíční období bez léčby.

Referenční zásah. Název léčivé látky: Placebo. Způsob podání: Perorálně 5 ml perorálně každých 12 hodin po dobu 10 po sobě jdoucích dnů v měsíci. Délka léčby: 2 cykly kontinuální léčby ročně během 3letého období (6 cyklů). Každý cyklus zahrnuje tři měsíce léčby, po nichž následuje tříměsíční období bez léčby.

**Stejně tak budou obě ramena výslovně požadovat nekonzumaci alkoholu a konzumaci nehyperkalorické středomořské stravy po celou dobu studie pro všechny pacienty.

Metodologie. Pacienti, kteří splňují výše uvedená kritéria pro zařazení a vyloučení a úspěšně dokončili všechny screeningové testy, budou léčeni standardním testem nebo léčebnou medikací podle pokynů klinické praxe prostřednictvím randomizačního schématu 1:1.

Randomizace bude stratifikována v blocích podle dříve identifikovaných prognostických proměnných a aby se předešlo potenciálním matoucím proměnným a/nebo modifikátorům účinku distribuovaným náhodně nevyváženým způsobem: Child-Pugh skóre B a počet krevních destiček <100 000/mm3. Randomizace bude provedena podle zadání pomocí čísel předem vytvořených zaslepeným výzkumníkem a nezávislých na klinických charakteristikách a kontaktu s pacienty. Všechna čísla randomizace budou uložena v uzavřených neprůhledných obálkách a budou přidělována postupně podle pořadí zařazení do protokolu.

*Všechny vyvinuté události, jak primární, tak sekundární v průběhu studie, budou vyhodnoceny zaslepenou a nezávislou komisí na základě výchozích proměnných a randomizační alokace. Klinické události bude monitorovat a přehodnocovat tato komise, která se bude skládat ze 3 zkoušejících.

Expoziční proměnné.

• Klinická data

• Vzorky periferní krve pro měření cytokinů, LPS a exprese TLR 4.

  • Cytokiny: Měření cytokinů bude provedeno z plazmy vzorků periferní krve. Hladiny následujících cytokinů budou kvantifikovány v pg/ml: IL-6, TNF-a a endotoxémie nebo bakteriální lipopolysacharid (LPS). Operátoři tohoto měření budou zaslepeni vůči jakékoli klinické, mikrobiomové a léčebné alokaci. Vzorky odebrané od každého jednotlivce: dvě 10ml zkumavky plné krve, jedna s EDTA (ethylendiamintetraacetát sodný) a druhá bez antikoagulantu, k použití v rutinních laboratorních studiích a při měření cytokinů (IL6 a TNF alfa) a endotoxinů ( LPS). Kvantifikace plazmatických cytokinů: Komerční reagencie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) budou použity k měření hladin cytokinů přítomných v plazmě pacientů. Koncentrace TNF alfa a IL-6 budou měřeny komerčními činidly eBioscience, affymetrix nebo podobnými komerčními činidly dostupnými na trhu, přesně podle pokynů příslušných výrobců. Pro kvantifikaci cytokinů budou křivky vytvořeny s odpovídajícími koncentračními standardy.
  • Kvantifikace endotoxinů v plazmě nebo séru: Měření bakteriálního LPS bude provedeno pomocí Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), Biosafe Srl chromogenic endpoint reagent nebo podobně, paralelně s koncentrační křivkou standardů. Budou dodržovány pokyny výrobce.
  • Exprese TLR 4 v mononukleárních buňkách periferní krve: exprese TLR 4 v mononukleárních buňkách bude kvantifikována technikou real-time PCR s použitím specifických primerů.

  • Vzorky stolice pro hodnocení střevního mikrobiomu.

    1. Způsob odběru: Vzorek spontánní fekální stolice bude odebrán kdykoli během dne do dodávaného potrubí, aby se zabránilo kontaktu s toaletami/materiály bez zápachu. Jakmile je vzorek odebrán, vhodně uzavřený sběrač se umístí do bezpečnostního sáčku a do krabice sady. Tyto vzorky budou skladovány zmrazené při -70º. Každý vzorek stolice musí být řádně označen. Později budou vzorky rozděleny do alikvotů pro konečné zpracování.
    2. Analýza: Fekální stolice budou odebrány za účelem analýzy střevního mikrobiomu pomocí techniky PCR, Ilumina, analyzující oblasti V3-V4 16sRNA v biotechnologickém institutu v Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). 16S ribozomální podjednotka rRNA bude analyzována bakteriálně, amplifikace pomocí metody PCR (20 cyklů) a poté druhé kolo amplifikace pro začlenění multiplexních adaptérů (čárové kódy) (10 cyklů). V každém postupu budou provedena dvě měření, aby se zabránilo zkreslení amplifikačních informací. Masivní sekvenování bude provedeno na týmu illumina MiSeq z institutu HERITAS (CIBIC + INDEAR) v režimu 2x300, aby bylo nakonec získáno minimálně 40 000 sekvencí na jednotlivce. Kvalita nezpracovaných dat bude vyhodnocena FastQC a informace o párových koncích Illumina budou kombinovány pomocí PEAR (v0.9.10). Odečty jsou poté filtrovány podle kvality Q30 a duplikáty a PCR chiméry jsou eliminovány pomocí UCHIME. Filtrované sekvence budou seskupeny v operačních taxonomických jednotkách (OTU) s 97% podobností s jejich vlastní strategií implementovanou v QIIME (v1.91). Operátoři tohoto měření budou slepí vůči klinickým proměnným, mikrobiomům a primárním událostem.
• Následující měření budou prováděna každých 6 měsíců u každého zařazeného subjektu až do konce studie nebo rozvoje primární příhody: hmotnost a výška, souběžná medikace, kompletní fyzikální vyšetření, laboratorní testy, Child Pugh skóre, ultrazvuk břicha.
• Podélné odběry vzorků střevního mikrobiomu a cytokinů. Druhé měření cytokinů bude provedeno ze séra ze vzorků periferní krve a střevního mikrobiomu ve vzorcích stolice u všech pacientů zařazených do studie na konci prvního léčebného cyklu (3. měsíc od randomizace nebo 12 týdnů) a na konci studie (poslední cyklus) za použití stejné metodiky popsané výše.

Adherence a sledování: Všichni pacienti budou pokračovat v protokolu až do rozvoje primární příhody nebo do jejího ukončení, po dokončení postrandomizačního sledování po dobu 3 let. Bude provedeno několik opatření k posílení adherence k léčbě v obou větvích a strategiích, aby se zabránilo ztrátě sledování. Dodržování léčebné kompliance bude definováno u 80 % tablet dodaných pro obě ramena.

Výpočet velikosti vzorku a statistická analýza: Bude použita dvoustranná statistická hodnota, chyba α nebo typu I 5 % (hodnota p <0,05) a síla nebo chyba typu II nebo β 0,20 (mocnice 80 %). Riziko HCC v každém rameni bude porovnáno pomocí Coxovy regresní analýzy s poměry rizik (HR) a 95% intervaly spolehlivosti a bude vypočítán počet potřebný k léčbě, aby se zabránilo klinickému výsledku, provedené podle principu intence-to-treat . Vzhledem k tomu, že kumulativní incidence HCC z předchozích údajů z literatury je 1–6 % ročně, bylo odhadnuto, že snížení relativního rizika rozvoje HCC během 3letého období v rameni s intervencí je klinicky relevantní s 30% relativním rozdílem, ekvivalentní HR 0,7. Pro každé rameno, velikost vzorku 140 subjektů, s celkovou populací 280 pacientů, odhadovaný počet primárních příhod na 28.

Všechny statistické analýzy budou prováděny pomocí STATA verze 14.0.

Analýza metadat mikrobiomu. Bioinformatická analýza dat bude provedena pomocí přizpůsobeného potrubí QIIME. Pro odhad diferenciální abundance mezi skupinami používáme balíček DESeq2.