Probiotiques dans la prévention du carcinome hépatocellulaire dans la cirrhose

Question de recherche La modulation du microbiome intestinal avec des probiotiques empêche-t-elle le développement du carcinome hépatocellulaire chez les patients atteints de cirrhose ? Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité des probiotiques dans la réduction de l'incidence du carcinome hépatocellulaire chez les patients atteints de cirrhose de Child Pugh A-B avec hypertension portale.

Méthodes Conception de l'étude. Essai interventionnel de phase III, multicentrique, randomisé, en double aveugle, contrôlé par placebo.

L'étude suivante sera réalisée conformément aux directives CONSORT. Scénario et temporalité. L'étude sera développée en Argentine, y compris les centres de soins aux patients avec les critères d'inclusion et d'exclusion suivants, à partir du 1er avril 2019 (phase de recrutement de 12 mois) jusqu'à ce que le dernier patient inscrit termine le suivi de 3 ans à compter de la randomisation.

Intervention. Médicament(s) à tester. Le probiotique et le placebo seront présentés dans le même contenant, la même forme et la même couleur.

Nom de la substance active Chaque flacon de 50 ml contient Lactobacillus casei 3,3 x 107 UFC/jour, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 UFC/jour, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 UFC/jour et Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 UFC/jour (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentine) .

Mode d'administration : Orale 5 ml par voie orale toutes les 12 heures pendant 10 jours consécutifs par mois. Durée du traitement : 2 cycles de traitement continu par an pendant une période de 3 ans (6 cycles). Chaque cycle comprend trois mois de traitement, suivis d'une période d'arrêt de trois mois.

Intervention de référence. Nom de la substance active : Placebo. Mode d'administration : Orale 5 ml par voie orale toutes les 12 heures pendant 10 jours consécutifs par mois. Durée du traitement : 2 cycles de traitement continu par an pendant une période de 3 ans (6 cycles). Chaque cycle comprend trois mois de traitement, suivis d'une période d'arrêt de trois mois.

** De même, les deux bras demanderont explicitement la non-consommation d'alcool et la consommation d'un régime méditerranéen non hypercalorique tout au long de l'étude pour tous les patients.

Méthodologie. Les patients qui répondent aux critères d'inclusion et d'exclusion susmentionnés et qui ont réussi tous les tests de dépistage seront traités avec le test standard ou les médicaments de traitement conformément aux directives de pratique clinique via un schéma de randomisation 1: 1.

La randomisation sera stratifiée en blocs selon des variables pronostiques préalablement identifiées et afin d'éviter d'éventuelles variables confondantes et/ou modificateurs d'effet distribués au hasard de manière déséquilibrée : score de Child Pugh B et numération plaquettaire < 100 000/mm3. La randomisation sera effectuée en fonction de l'assignation au moyen de numéros préalablement établis par un chercheur en aveugle et indépendants des caractéristiques cliniques et du contact avec les patients. Tous les numéros de la randomisation seront stockés dans des enveloppes opaques fermées et seront attribués consécutivement selon l'ordre d'inclusion dans le protocole.

*Tous les événements développés, primaires et secondaires tout au long de l'étude, seront évalués par un comité en aveugle et indépendant à partir de variables de base et d'une répartition aléatoire. Les événements cliniques seront suivis et réévalués par ce comité qui sera composé de 3 investigateurs.

Variables d'exposition.

• Donnée clinique

• Échantillons de sang périphérique pour la mesure des cytokines, du LPS et de l'expression du TLR 4.

  • Cytokines : La mesure des cytokines sera faite à partir de plasma d'échantillons de sang périphérique. Les niveaux des cytokines suivantes seront quantifiés en pg/ml : IL-6, TNF-α et endotoxémie ou lipopolysaccharide bactérien (LPS). Les opérateurs de cette mesure seront aveuglés à toute allocation clinique, de microbiome et de traitement. Échantillons à prélever sur chaque individu : deux tubes de 10 ml de sang total, l'un avec EDTA (éthylènediaminetétraacétate de sodium) et l'autre sans anticoagulant, à utiliser dans les études de laboratoire de routine et dans le dosage des cytokines (IL6 et TNF alpha) et des endotoxines ( LPS). Quantification des cytokines plasmatiques : Des réactifs commerciaux de dosage immuno-enzymatique (ELISA) seront utilisés pour mesurer les niveaux de cytokines présentes dans les plasmas des patients. Les concentrations de TNF alpha et d'IL-6 seront mesurées avec des réactifs commerciaux d'eBioscience, affymetrix ou un réactif commercial similaire disponible sur le marché, en suivant strictement les instructions des fabricants respectifs. Pour la quantification des cytokines, les courbes seront réalisées avec les étalons de concentration correspondants.
  • Quantification des endotoxines dans le plasma ou le sérum : la mesure du LPS bactérien sera effectuée par Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), réactif chromogène Biosafe Srl ou similaire, parallèlement à la courbe de concentration des étalons. Les instructions du fabricant seront suivies.
  • Expression de TLR 4 dans les cellules mononucléaires du sang périphérique : l'expression de TLR 4 dans les cellules mononucléaires sera quantifiée par la technique de PCR en temps réel, en utilisant des amorces spécifiques.

  • Échantillons de selles pour l'évaluation du microbiome intestinal.

    1. Méthode de prélèvement : Un échantillon de selles fécales spontanées sera prélevé à tout moment de la journée dans un collecteur fourni en évitant tout contact avec les toilettes/matériaux inodores. Une fois l'échantillon prélevé, le collecteur correctement fermé sera placé à l'intérieur d'un sac de sécurité et à l'intérieur d'une boîte de kit. Ces échantillons seront conservés congelés à -70º. Chaque échantillon fécal doit être correctement étiqueté. Plus tard, les échantillons seront aliquotés pour le traitement final.
    2. Analyse : Les selles fécales seront collectées pour analyser le microbiome intestinal à l'aide de la technique PCR, Ilumina, analysant les régions V3-V4 du 16sARN à l'Institut de biotechnologie de Rosario (INDEAR, Rosario, Argentine). La sous-unité ribosomale 16S de l'ARNr sera analysée bactérienne, amplifiée à l'aide de la méthode PCR (20 cycles), puis une deuxième série d'amplification pour incorporer des adaptateurs multiplex (codes à barres) (10 cycles). Dans chaque procédure, deux mesures seront effectuées pour éviter les biais d'information d'amplification. Le séquençage massif sera réalisé sur une équipe illumina MiSeq de l'institut HERITAS (CIBIC + INDEAR) en mode 2x300 pour obtenir au final un minimum de 40 000 séquences par individu. La qualité des données brutes sera évaluée par FastQC et les informations des extrémités de paires d'Illumina seront combinées à l'aide de PEAR (v0.9.10). Les lectures sont ensuite filtrées par qualité Q30 et les doublons et les chimères PCR sont éliminés à l'aide d'UCHIME. Les séquences filtrées seront regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à 97 % de similarité avec leur propre stratégie mise en œuvre dans QIIME (v1.91). Les opérateurs de cette mesure seront aveugles aux variables cliniques, au microbiome et aux événements primaires.
• Les mesures suivantes seront effectuées tous les 6 mois chez chaque sujet inscrit jusqu'à la fin de l'étude ou du développement de l'événement principal : poids et taille, médication concomitante, examen physique complet, tests de laboratoire, score de Child Pugh, échographie abdominale.
• Échantillonnage longitudinal du microbiome intestinal et des cytokines. Une deuxième mesure de cytokines sera effectuée à partir de sérum provenant d'échantillons de sang périphérique et de microbiome intestinal dans des échantillons fécaux chez tous les patients inclus dans l'étude à la fin du premier cycle de traitement (3ème mois depuis la randomisation ou 12 semaines) et à la fin de l'étude (dernier cycle) en utilisant la même méthodologie décrite ci-dessus.

Adhésion et suivi : Tous les patients continueront dans le protocole jusqu'au développement de l'événement primaire ou jusqu'à la fin de celui-ci, après avoir effectué un suivi post-randomisation de 3 ans. Plusieurs mesures seront menées pour renforcer l'adhésion au traitement dans les deux bras et les stratégies pour éviter les pertes de suivi. L'adhésion à l'observance du traitement sera définie dans 80% des comprimés délivrés pour les deux bras.

Calcul de la taille de l'échantillon et analyse statistique : Une valeur statistique bilatérale sera prise, une erreur α ou de type I de 5 % (valeur p <0,05) et une puissance ou une erreur de type II ou β de 0,20 (puissance de 80 %). Le risque de CHC dans chaque bras sera comparé à l'aide d'une analyse de régression de Cox avec des rapports de risque (HR) et des intervalles de confiance à 95 % et le nombre nécessaire de traiter pour prévenir un résultat clinique sera calculé, selon le principe de l'intention de traiter . Étant donné que l'incidence cumulée du CHC à partir des données précédentes de la littérature est de 1 à 6 % par an, une réduction du risque relatif de développement du CHC au cours d'une période de 3 ans dans le groupe d'intervention a été estimée comme étant cliniquement pertinente avec une différence relative de 30 %, équivalent à un HR de 0,7. Pour chaque bras, un échantillon de 140 sujets, avec une population totale à recruter de 280 patients, nombre estimé d'événements primaires sur 28.

Toutes les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de STATA version 14.0.

Analyse des métadonnées du microbiome. L'analyse bioinformatique des données sera effectuée à l'aide d'un pipeline QIIME personnalisé. Pour l'estimation de l'abondance différentielle entre les groupes, nous utilisons le package DESeq2.