環境電磁放射に対する新しいデバイスの検証

研究に登録された正常な健康な男性は、デバイスの使用前に精液標本を提供するよう求められます。 サンプルは、最低 48 ～ 72 時間禁酒して作成されます。 さらに、被験者は偽Qi-ShieldまたはQi-Shieldデバイスのいずれかを盲目的に割り当てられ、デバイスを8週間使用するように指示されます。精液サンプルは、被験者から0、4、および8週間の間隔で提供されます。 .

グループ 1 の被験者には偽の Qi-Shield デバイスが提供され、グループ 2 の被験者には実際の Qi-Shield デバイスが提供されます。 各ユーザーには、旅行中にデバイスを収納するための小さなキャリー バッグが提供されます。 参加者は、製造元の指示に従って、8 週間、デバイスを 3 メートルの範囲内に保つことをお勧めします。

精液分析 すべての標本は、性的禁欲の 48-72 時間後にアンドロロジー研究所でマスターベーションによって収集されます。 さらに処理する前に、サンプルを 37℃ で 15 ～ 20 分間完全に液化させます。 完全に液化した後、自動化された LensHooke™ X1 PRO 精液品質分析装置 (Bonraybio Co., Ltd) を使用して精液分析を行い、精子の濃度と運動性、進行性運動性を測定します (Agarwal et al., 2019)。 生存率は、運動性が 25% 未満の場合、エオシン - ニグロシン染色によって決定されます。 生精液の塗抹標本は、WHO の第 5 版ガイドラインに記載されている厳格な基準に従って精子の形態を評価するために、Diff-Quik キット (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) で染色されます。

白血球測定 精液中の円形細胞濃度が >1 X 百万/mL または高倍率視野あたり >5 円形細胞である場合、サンプルは白血球精子症、すなわち >1 X 百万白血球/mL について検査されます。 これは、ペルオキシダーゼまたは Endtz テストによって確認されます。

酸化還元電位の測定 ORP は、還元剤 (または酸化防止剤) から酸化剤への電子の移動を測定します。 ORP はミリボルト (mV) で測定されます。 現在の研究では、ORP は新しいガルバノスタット ベースの技術 - MiOXSYS システム (Aytu Bioscience、エングルウッド、コロラド州) を使用して測定されます。 簡単に言うと、30µL の液化精液が MiOXSYS センサーにロードされます。 センサーは MiOXSYS アナライザーに挿入されます。 mV で測定される静的 ORP (sORP) は、生物系における全酸化剤と還元剤の間の既存のバランスの統合された測定値です。 データは精子濃度で正規化されます。 ORP は mV/100 万精子/mL で表されます。

DNA断片化 DNA断片化は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンド標識アッセイ（TUNELアッセイ）によって評価されます。 簡単に説明すると、200 万個の精子をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、3.7% パラホルムアルデヒドに再懸濁します。 合計 2 つのアリコート (A と B) が各ドナーに使用され、1 つは ORP 測定用、もう 1 つは精子 DNA 断片化の測定用です。 これらは、4℃で30〜60分間氷上に置かれます。 その後、精子を再び洗浄してパラホルムアルデヒドを除去し、次いで70%氷冷エタノールに再懸濁し、分析時まで-20℃で保存する。

精子ＤＮＡ断片化は、Ａｐｏ－ＤｉｒｅｃｔＴＭキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたＴＵＮＥＬアッセイを使用して評価される。 メーカーが提供する陽性および陰性のキットコントロールと、過酸化水素コントロールで処理して調製した陽性テストが、各実行に含まれます。 エタノールを除去するために PBS で 2 回目の洗浄を行った後、精子ペレットを 50 μL の新たに調製した染色液に 37 C で 60 分間再懸濁します。 染色液には、ターミナル デオキシトランスフェラーゼ (TdT) 酵素、TdT 反応バッファー、フルオレセイン イソチオシアネート タグ付きデオキシウリジン三リン酸ヌクレオチド (FITC-dUTP) および蒸留水が含まれています。 すべての標本をすすぎバッファーでさらに洗浄し、0.5 mL のヨウ化プロピジウム/RNase 溶液に再懸濁し、30 分間インキュベートした後、フローサイトメトリー分析を行います。

BD C6 Acuri サイトメトリー分析: 標識された精子のすべての蛍光シグナルは、フローサイトメーター BD Accuri フローサイトメーター (Becton Dickinson、カリフォルニア州サンノゼ) によって分析されます。 約 10,000 個の精子が、各アッセイで <100 細胞/秒の低速流速で検査されます。 レーザー励起は、20mW の固体青色レーザーによって供給される 488 nm の 2 つの波長と、14.7mW ダイオード赤色レーザーによって電力を供給される 640 nm で提供されます。 緑色蛍光 (480-530 nm) は FL-1 チャネルで測定され、赤色蛍光 (640 nm) は FL-2 チャネルで測定されます。 陽性細胞 (TUNEL 陽性) の割合は、フローサイトメーター ソフトウェアを使用して計算されます。

プロテオミクス解析 各グループから収集された個々のサンプルは、白血球を特異的に除去するために 65% パーコール勾配にかけられます。 精液サンプルは PBS で 3 回洗浄されます。 上清が除去されると、精子は、プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含む放射性免疫沈降アッセイ (RIPA) 溶解バッファーで可溶化されます。 精子を完全に溶解した後、ビシンコニン酸（BCA）キットを使用してタンパク質濃度を測定し、SDS-Page 1D ゲル電気泳動を使用して等量のタンパク質を分画します。 分離されたバンドは、単一のクーマシー ブルー染色 1D ゲルから切り出され、分析されます。 バンドはトリプシンで洗浄、還元、アルキル化、消化されます。 消化物は、キャピラリー カラム LC タンデム MS によって分離され、CID スペクトルは、ヒト参照配列データベースに対して検索されます。

機能注釈と濃縮分析は、GO Term Finder、GO Term Mapper、UniProt、タンパク質の注釈を研究するためのソフトウェア ツール (STRAP)、注釈、視覚化、および統合された発見のためのデータベース (DAVID) などの公的に利用可能なバイオインフォマティクス注釈ツールおよびデータベースを使用して実行されます。 (http://david.niaid.nih.gov)、および Ingenuity® Systems の IPA (Ingenuity Pathway Analysis) などの独自のソフトウェア パッケージを使用して、プロテオミクスに由来する多数のタンパク質リストのコンセンサスに基づく包括的な機能的コンテキストを取得します。勉強。 データは、既知および予測されるタンパク質間相互作用の生物学的データベースおよび Web リソースである STRING (相互作用する遺伝子/タンパク質の検索ツール) の対象となります。 これは、生殖機能に関与する重要なタンパク質を特定するのに役立ちます。

データ分析 すべてのデータは、MedCalc ソフトウェア (V. 17.8; MedCalc ソフトウェア、オステンド、ベルギー）。 分布が正規分布の場合、対応のある t 検定が使用されます。 一方、ウィルコクソンの符号付き順位検定は、正規分布に従わないパラメーターに使用されます。 各実験の 20 個のサンプルに基づく対応のある t 検定の比較では、変動係数が 20% 以下のパラメーターの検出力は少なくとも 90% である必要があります。