Validierung neuer Geräte gegen elektromagnetische Umgebungsstrahlung

Normale gesunde Männer, die an der Studie teilnehmen, werden gebeten, vor der Verwendung des Geräts Samenproben abzugeben. Die Proben werden mit mindestens 48-72 Stunden Abstinenz hergestellt. Darüber hinaus werden den Probanden blind entweder ein Schein-Qi-Shield- oder ein Qi-Shield-Gerät zugewiesen und sie werden angewiesen, das Gerät für eine Dauer von 8 Wochen zu verwenden. Samenproben werden von den Probanden in Abständen von 0, 4 und 8 Wochen zur Verfügung gestellt .

Die Studienteilnehmer der Gruppe 1 erhalten ein Schein-Qi-Shield-Gerät, während die Studienteilnehmer der Gruppe 2 ein tatsächliches Qi-Shield-Gerät erhalten. Jedem Benutzer wird eine kleine Tragetasche zur Verfügung gestellt, um das Gerät während der Reise unterzubringen. Den Teilnehmern wird empfohlen, das Gerät gemäß den Herstelleranweisungen für eine Dauer von 8 Wochen in einem Umkreis von 3 Metern zu halten.

Samenanalyse Alle Proben werden nach 48-72 Stunden sexueller Abstinenz durch Masturbation im Andrologischen Labor entnommen. Die Proben können sich vor der weiteren Verarbeitung 15-20 Minuten lang bei 37 °C vollständig verflüssigen. Nach vollständiger Verflüssigung wird die Samenanalyse mit dem automatisierten LensHooke™X1 PRO Samenqualitätsanalysegerät (Bonraybio Co., Ltd) durchgeführt, um die Spermienkonzentration und -beweglichkeit sowie die progressive Beweglichkeit zu bestimmen (Agarwal et al., 2019). Die Lebensfähigkeit wird durch Eosin-Nigrosin-Färbung bestimmt, wenn die Motilität < 25 % beträgt. Abstriche des rohen Samens werden mit einem Diff-Quik-Kit (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) zur Beurteilung der Spermienmorphologie gemäß den strengen Kriterien, wie in der WHO-Richtlinie, 5. Ausgabe, beschrieben, gefärbt.

Messung der weißen Blutkörperchen Wenn die Konzentration der runden Blutkörperchen im Ejakulat >1 X Millionen/ml oder >5 Rundzellen pro Hochleistungsfeld beträgt, wird die Probe auf Leukozytospermie getestet, d. h. >1 X Millionen weiße Blutkörperchen/ml. Dies wird durch den Peroxidase- oder den Endtz-Test bestätigt.

Messung des Oxidations-Reduktions-Potentials ORP misst die Übertragung von Elektronen von einem Reduktionsmittel (oder Antioxidans) auf ein Oxidationsmittel. ORP wird in Millivolt (mV) gemessen. In der aktuellen Studie wird ORP mit einer neuartigen Galvanostat-basierten Technologie gemessen – dem MiOXSYS-System (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Kurz gesagt, 30 µl verflüssigter Samen werden auf den MiOXSYS-Sensor geladen. Der Sensor wird in das MiOXSYS-Analysegerät eingeführt. Das statische ORP (sORP), gemessen in mV, ist das integrierte Maß für das vorhandene Gleichgewicht zwischen den gesamten Oxidantien und Reduktionsmitteln in einem biologischen System. Die Daten werden mit der Spermienkonzentration normalisiert. ORP wird als mV/Million Spermien/ml ausgedrückt.

DNA-Fragmentierung Die DNA-Fragmentierung wird mittels des terminalen Desoxynukleotidyltransferase-vermittelten dUTP-Nick-End-Labeling-Assays (TUNEL-Assay) bewertet. Kurz gesagt werden 2 Millionen Spermien in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in 3,7 % Paraformaldehyd resuspendiert. Für jeden Spender werden insgesamt 2 Aliquots (A und B) verwendet, eines für die ORP-Messung und das andere für die Messung der Spermien-DNA-Fragmentierung. Diese werden für 30–60 Minuten bei 4°C auf Eis gelegt. Danach werden die Spermien erneut gewaschen, um das Paraformaldehyd zu entfernen, und dann erneut in 70 % eiskaltem Ethanol suspendiert und bis zum Zeitpunkt der Analyse bei -20 °C gelagert.

Die Spermien-DNA-Fragmentierung wird unter Verwendung eines TUNEL-Assays mit einem Apo-DirectTM-Kit (Pharmingen, San Diego, CA) bewertet. Positive und negative Kit-Kontrollen, die vom Hersteller bereitgestellt werden, und positive Tests, die durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid-Kontrollen hergestellt wurden, werden für jeden Lauf mitgeführt. Nach einer zweiten Waschung in PBS zur Entfernung von Ethanol werden die Spermienpellets in 50 µl frisch zubereiteter Färbelösung für 60 Minuten bei 37 °C resuspendiert. Die Färbelösung enthält das Enzym Terminale Desoxytransferase (TdT), TdT-Reaktionspuffer, Fluorescein-Isothiocyanat-markierte Desoxyuridintriphosphat-Nukleotide (FITC-dUTP) und destilliertes Wasser. Alle Proben werden weiter in Spülpuffer gewaschen und in 0,5 ml Propidiumiodid/RNase-Lösung resuspendiert und für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse.

BD C6 Acuri-Zytometrieanalyse: Alle Fluoreszenzsignale markierter Spermatozoen werden mit dem Durchflusszytometer BD Accuri Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Etwa 10.000 Spermien werden für jeden Assay bei einer langsamen Flussrate von <100 Zellen/Sek. untersucht. Die Laseranregung erfolgt bei 2 Wellenlängen von 488 nm, die von einem blauen Festkörperlaser mit 20 mW und 640 nm, angetrieben von einem 14,7 mW roten Diodenlaser, geliefert werden. Grüne Fluoreszenz (480–530 nm) wird im FL-1-Kanal und rote Fluoreszenz (640 nm) im FL-2-Kanal gemessen. Der Prozentsatz positiver Zellen (TUNEL-positiv) wird mit der Durchflusszytometer-Software berechnet.

Proteomische Analyse Von jeder Gruppe gesammelte individuelle Proben werden einem 65% Percoll-Gradienten ausgesetzt, um die weißen Blutkörperchen spezifisch zu entfernen. Samenproben werden dreimal mit PBS gewaschen. Sobald der Überstand entfernt ist, werden die Spermien in Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer, der den Proteinase-Inhibitor-Cocktail enthält, solubilisiert. Nach vollständiger Lyse der Spermien wird die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Kit bestimmt und gleiche Proteinmengen werden mit SDS-Page 1D-Gelelektrophorese fraktioniert. Aus einem einzelnen, mit Coomassie-Blau gefärbten 1D-Gel werden getrennte Banden ausgeschnitten und analysiert. Die Banden werden gewaschen, reduziert, alkyliert und mit Trypsin verdaut. Die Verdaus werden durch Kapillarsäulen-LC-Tandem-MS aufgetrennt und die CID-Spektren gegen die Human-Referenzsequenz-Datenbank durchsucht.

Funktionelle Annotations- und Anreicherungsanalysen werden unter Verwendung öffentlich verfügbarer Bioinformatik-Annotationstools und -datenbanken wie GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) durchgeführt. (http://david.niaid.nih.gov) und ein proprietäres Softwarepaket wie IPA (Ingenuity Pathway Analysis) von Ingenuity® Systems, das verwendet wird, um einen konsensbasierten, umfassenden funktionalen Kontext für die große Liste von Proteinen zu erhalten, die aus der Proteomik stammen lernen. Die Daten werden STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), einer biologischen Datenbank und Webressource bekannter und vorhergesagter Protein-Protein-Wechselwirkungen, zugeführt. Dies hilft bei der Identifizierung kritischer Proteine, die an der Fortpflanzungsfunktion beteiligt sind.

Datenanalyse Alle Daten werden mit Hilfe der MedCalc Software (V. 17,8; MedCalc Software, Ostende, Belgien). Der gepaarte t-Test wird verwendet, wenn die Verteilung normal ist. Dagegen werden Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests für Parameter verwendet, die nicht der Normalverteilung folgen. Für gepaarte T-Test-Vergleiche basierend auf 20 Stichproben für jedes Experiment sollte die Trennschärfe mindestens 90 % für Parameter betragen, bei denen der Variationskoeffizient nicht mehr als 20 % beträgt.