Validação de Novos Dispositivos Contra Radiação Eletromagnética Ambiente

Homens normais e saudáveis ​​inscritos no estudo serão solicitados a fornecer amostras de sêmen antes do uso do dispositivo. As amostras serão produzidas com um mínimo de 48-72 horas de abstinência. Além disso, os indivíduos serão designados cegamente com o dispositivo Qi-Shield ou Qi-Shield falso e serão instruídos a usar o dispositivo por um período de 8 semanas. Amostras de sêmen serão fornecidas pelos indivíduos em intervalos de 0, 4 e 8 semanas .

Os participantes do estudo do Grupo 1 receberão um dispositivo Qi-Shield falso, enquanto os participantes do estudo do Grupo 2 receberão um dispositivo Qi-Shield real. Cada usuário receberá uma pequena sacola para acomodar o dispositivo durante a viagem. Os participantes são aconselhados a manter o dispositivo dentro de 3 metros de alcance de acordo com as instruções do fabricante por um período de 8 semanas.

Análise de sêmen Todas as amostras serão coletadas por masturbação no Laboratório de Andrologia após 48-72 horas de abstinência sexual. As amostras poderão se liquefazer completamente por 15 a 20 minutos a 37°C antes do processamento posterior. Após a liquefação completa, a análise do sêmen será realizada usando o analisador automático de qualidade do sêmen LensHooke™X1 PRO (Bonraybio Co., Ltd) para determinar a concentração e motilidade espermática, motilidade progressiva (Agarwal et al., 2019). A viabilidade será determinada pela coloração Eosina-Nigrosina se a motilidade for <25%. Esfregaços do sêmen bruto serão corados com um kit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) para avaliação da morfologia do esperma de acordo com critérios rígidos conforme descrito na diretriz da 5ª edição da OMS.

Medição de glóbulos brancos Quando a concentração de células redondas no ejaculado for >1 X milhão/mL ou >5 células redondas por campo de alta potência, a amostra será testada para leucocitospermia, ou seja, >1 X milhão de glóbulos brancos/mL. Isso será confirmado pelo teste de peroxidase ou Endtz.

Medição do potencial de redução da oxidação ORP mede a transferência de elétrons de um redutor (ou antioxidante) para um oxidante. ORP é medido em milivolts (mV). No estudo atual, o ORP será medido usando a nova tecnologia baseada em galvanostato - o Sistema MiOXSYS (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Resumidamente, 30µL de sêmen liquefeito serão carregados no sensor MiOXSYS. O sensor será inserido no analisador MiOXSYS. O ORP estático (sORP), medido em mV, é a medida integrada do equilíbrio existente entre oxidantes totais e redutores em um sistema biológico. Os dados serão normalizados com a concentração de esperma. ORP será expresso em mV/ milhão de espermatozoides/mL.

Fragmentação do DNA A fragmentação do DNA será avaliada por meio do ensaio de rotulagem de nick-end mediado por desoxinucleotidil transferase terminal (ensaio TUNEL). Resumidamente, 2 milhões de espermatozoides serão lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ressuspensos em paraformaldeído a 3,7%. Um total de 2 alíquotas (A e B) serão utilizadas para cada doador, uma para medição de ORP e outra para medição de fragmentação do DNA espermático. Estes serão colocados no gelo por 30-60 minutos a 4C. Em seguida, os espermatozoides serão novamente lavados para retirada do paraformaldeído e, em seguida, ressuspensos em etanol 70% gelado, armazenados a -20C até o momento da análise.

A fragmentação do DNA do esperma será avaliada usando um ensaio TUNEL com um kit Apo-DirectTM (Pharmingen, San Diego, CA). Os controles do kit positivo e negativo fornecidos pelo fabricante e o teste positivo preparado por tratamento com controles de peróxido de hidrogênio serão incluídos para cada execução. Após uma segunda lavagem em PBS para remover o etanol, os pellets de esperma são ressuspensos em 50 µl de solução de coloração preparada na hora por 60 minutos a 37°C. A solução de coloração contém enzima desoxitransferase terminal (TdT), tampão de reação TdT, nucleotídeos trifosfato de desoxiuridina marcados com isotiocinato de fluoresceína (FITC-dUTP) e água destilada. Todas as amostras são posteriormente lavadas em tampão de enxágue e ressuspensas em 0,5 mL de solução de iodeto de propídio/RNase e incubadas por 30 minutos, seguidas de análise por citometria de fluxo.

Análise de citometria BD C6 Acuri: Todos os sinais de fluorescência de espermatozóides marcados serão analisados ​​pelo citômetro de fluxo BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Cerca de 10.000 espermatozóides serão examinados para cada ensaio a uma taxa de fluxo lento de <100 células/seg. A excitação do laser é fornecida em 2 comprimentos de onda de 488 nm fornecidos por um laser de estado azul sólido a 20mW e 640 nm alimentado por um laser de diodo vermelho de 14,7mW. A fluorescência verde (480-530 nm) é medida no canal FL-1 e a fluorescência vermelha (640 nm) no canal FL-2. A porcentagem de células positivas (TUNEL-positivas) será calculada usando o software do citômetro de fluxo.

Análise proteômica Amostras individuais coletadas de cada grupo serão submetidas a gradiente de percoll de 65% para remover especificamente os glóbulos brancos. As amostras de sêmen serão lavadas com PBS três vezes. Uma vez removido o sobrenadante, os espermatozoides serão solubilizados em tampão de lise por ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo o coquetel de inibidores de proteinase. Após a lise completa dos espermatozóides, a concentração de proteínas será determinada usando um kit de ácido bicinconínico (BCA) e quantidades iguais de proteínas serão fracionadas usando eletroforese em gel SDS-Page 1D. Bandas separadas serão cortadas de um único gel 1D corado com azul de Coomassie e analisadas. As bandas serão lavadas, reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina. Os digeridos serão separados por coluna capilar LC-tandem MS e os espectros CID pesquisados ​​no banco de dados de sequências de referência humanas.

A anotação funcional e a análise de enriquecimento serão realizadas usando ferramentas de anotação de bioinformática publicamente disponíveis e bancos de dados, como GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID). (http://david.niaid.nih.gov) e pacote de software proprietário, como IPA (Ingenuity Pathway Analysis) da Ingenuity® Systems, usado para obter contexto funcional abrangente e baseado em consenso para a grande lista de proteínas derivadas de proteômica estudar. Os dados serão submetidos a STRING (Ferramenta de Pesquisa para a Recuperação de Genes/Proteínas Interagentes), um banco de dados biológico e recurso da web de interações proteína-proteína conhecidas e previstas. Isso ajudará na identificação de proteínas críticas envolvidas na função reprodutiva.

Análise de dados Todos os dados serão analisados ​​usando o software MedCalc (V. 17.8; MedCalc Software, Ostende, Bélgica). O teste t pareado será usado se a distribuição for normal. Considerando que, os testes de postos assinados de Wilcoxon serão usados ​​para parâmetros que não seguem a distribuição normal. Para comparações de testes T pareados com base em 20 amostras para cada experimento, o poder deve ser de pelo menos 90% para parâmetros em que um coeficiente de variação não seja superior a 20%.