Validace nových zařízení proti okolnímu elektromagnetickému záření

Normální zdraví muži zařazení do studie budou požádáni, aby poskytli vzorky spermatu před použitím zařízení. Vzorky budou vyrobeny s minimálně 48-72 hodinovou abstinencí. Dále bude subjektům naslepo přiděleno buď falešné zařízení Qi-Shield nebo Qi-Shield a budou instruováni, aby zařízení používali po dobu 8 týdnů. Vzorky spermatu budou subjekty poskytovány v intervalu 0, 4 a 8 týdnů. .

Subjektům studie ve skupině 1 bude poskytnuto falešné zařízení Qi-Shield, zatímco subjektům studie ve skupině 2 bude poskytnuto skutečné zařízení Qi-Shield. Každý uživatel bude mít k dispozici malou tašku na přenášení zařízení během cesty. Účastníkům se doporučuje udržovat zařízení v dosahu 3 metrů podle pokynů výrobce po dobu 8 týdnů.

Analýza spermatu Všechny vzorky budou odebrány masturbací v Andrologické laboratoři po 48-72 hodinách sexuální abstinence. Vzorky se před dalším zpracováním nechají úplně zkapalnit po dobu 15-20 minut při 37 °C. Po úplném zkapalnění bude analýza spermatu provedena pomocí automatického analyzátoru kvality spermatu LensHooke™X1 PRO (Bonraybio Co., Ltd), aby se určila koncentrace a pohyblivost spermií, progresivní pohyblivost (Agarwal et al., 2019). Životaschopnost bude určena barvením Eosin-Nigrosin, pokud je motilita <25 %. Nátěry surového spermatu budou obarveny soupravou Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) pro hodnocení morfologie spermií podle přísných kritérií, jak je popsáno v pokynech WHO, 5. vydání.

Měření bílých krvinek Když je koncentrace kulatých krvinek v ejakulátu >1 x milion/ml nebo >5 kulatých buněk na vysoce výkonné pole, bude vzorek testován na leukocytospermii, tj. >1 x milion bílých krvinek/ml. To potvrdí peroxidáza nebo Endtzův test.

Měření oxidačně redukčního potenciálu ORP měří přenos elektronů z redukčního činidla (nebo antioxidantu) na oxidant. ORP se měří v milivoltech (mV). V této studii bude ORP měřen pomocí nové technologie založené na galvanostatu – systému MiOXSYS (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Stručně řečeno, 30 µl zkapalněného spermatu bude naloženo na senzor MiOXSYS. Senzor bude vložen do analyzátoru MiOXSYS. Statický ORP (sORP), měřený v mV, je integrovaným měřítkem existující rovnováhy mezi celkovými oxidanty a redukčními činidly v biologickém systému. Data budou normalizována s koncentrací spermií. ORP bude vyjádřen jako mV/ milion spermií/ml.

Fragmentace DNA Fragmentace DNA bude hodnocena pomocí terminální deoxynukleotidyltransferázy zprostředkované dUTP nick-end značením (test TUNEL). Stručně řečeno, 2 miliony spermií se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a resuspendují v 3,7% paraformaldehydu. Pro každého dárce budou použity celkem 2 alikvoty (A a B), jeden pro měření ORP a druhý pro měření fragmentace DNA spermatu. Ty budou umístěny na led na 30-60 minut při 4C. Poté se spermie znovu promyjí, aby se odstranil paraformaldehyd, a poté se resuspendují v 70% ledově chladném ethanolu, skladují se při -20 °C až do doby analýzy.

Fragmentace DNA spermií bude vyhodnocena pomocí testu TUNEL se soupravou Apo-DirectTM (Pharmingen, San Diego, CA). Pro každý běh budou zahrnuty pozitivní a negativní kontroly soupravy poskytnuté výrobcem a pozitivní test připravený ošetřením peroxidem vodíku. Po druhém promytí v PBS k odstranění ethanolu se pelety spermií resuspendují v 50 ul čerstvě připraveného barvícího roztoku po dobu 60 minut při 37 °C. Barvicí roztok obsahuje enzym terminální deoxytransferázu (TdT), reakční pufr TdT, nukleotidy deoxyuridintrifosfátu označené fluorescein isothiokynátem (FITC-dUTP) a destilovanou vodu. Všechny vzorky se dále promyjí v proplachovacím pufru a resuspendují v 0,5 ml roztoku propidium jodid/RNáza a inkubují 30 minut a následuje analýza průtokovou cytometrií.

Cytometrická analýza BD C6 Acuri: Všechny fluorescenční signály značených spermií budou analyzovány průtokovým cytometrem BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Pro každý test bude vyšetřeno asi 10 000 spermií při pomalé průtokové rychlosti <100 buněk/s. Buzení laseru je zajištěno na 2 vlnových délkách 488 nm dodávaných pevným modrým laserem o výkonu 20 mW a 640 nm napájeným 14,7 mW diodově červeným laserem. Zelená fluorescence (480-530 nm) se měří v kanálu FL-1 a červená fluorescence (640 nm) v kanálu FL-2. Procento pozitivních buněk (TUNEL-pozitivních) bude vypočítáno pomocí softwaru průtokového cytometru.

Proteomická analýza Jednotlivé vzorky odebrané z každé skupiny budou podrobeny 65% ​​percoll gradientu, aby se specificky odstranily bílé krvinky. Vzorky spermatu se třikrát promyjí PBS. Jakmile je supernatant odstraněn, spermie budou solubilizovány v lyzačním pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) obsahujícím koktejl inhibitorů proteinázy. Po úplné lýze spermií bude koncentrace proteinu stanovena pomocí soupravy kyseliny bicinchoninové (BCA) a stejná množství proteinů budou frakcionována pomocí gelové elektroforézy SDS-Page 1D. Oddělené pásy budou vyříznuty z jednoho 1D gelu obarveného Coomassie modří a analyzovány. Pásy budou promyty, redukovány, alkylovány a štěpeny trypsinem. Štěpení budou oddělena kapilární kolonou LC-tandem MS a CID spektra budou prohledána proti databázi lidských referenčních sekvencí.

Funkční anotace a analýza obohacení bude provedena pomocí veřejně dostupných bioinformatických anotačních nástrojů a databází, jako jsou GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Softwarové nástroje pro výzkum anotací proteinů (STRAP), Databáze pro anotaci, vizualizaci a integrované zjišťování (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov) a proprietární softwarový balík, jako je IPA (Ingenuity Pathway Analysis) od Ingenuity® Systems, který se používá k získání komplexního funkčního kontextu založeného na konsensu pro velký seznam proteinů odvozených z proteomických studie. Data budou podrobena STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), biologické databázi a webovému zdroji známých a předpokládaných interakcí protein-protein. To pomůže při identifikaci kritických proteinů zapojených do reprodukční funkce.

Analýza dat Všechna data budou analyzována pomocí softwaru MedCalc (V. 17,8; MedCalc Software, Ostende, Belgie). Pokud je rozdělení normální, použije se párový t-test. Zatímco Wilcoxonovy znaménkové testy budou použity pro parametry, které nesledují normální rozdělení. Pro porovnání párového T-testu založeného na 20 vzorcích pro každý experiment by síla měla být alespoň 90 % pro parametry, kde variační koeficient není větší než 20 %.