Validación de nuevos dispositivos frente a radiación electromagnética ambiental

A los hombres sanos normales inscritos en el estudio se les pedirá que proporcionen muestras de semen antes del uso del dispositivo. Las muestras se producirán con un mínimo de 48-72 horas de abstinencia. Además, a los sujetos se les asignará a ciegas un dispositivo Qi-Shield o Qi-Shield simulado y se les indicará que usen el dispositivo durante 8 semanas. Los sujetos proporcionarán muestras de semen a intervalos de 0, 4 y 8 semanas. .

A los sujetos del estudio del Grupo 1 se les proporcionará un dispositivo Qi-Shield falso, mientras que a los sujetos del estudio del Grupo 2 se les proporcionará un dispositivo Qi-Shield real. A cada usuario se le proporcionará una pequeña bolsa de transporte para acomodar el dispositivo durante su viaje. Se recomienda a los participantes que mantengan el dispositivo dentro de los 3 metros de distancia según las instrucciones del fabricante durante 8 semanas.

Análisis de semen Todos los especímenes serán recolectados por masturbación en el Laboratorio de Andrología después de 48-72 horas de abstinencia sexual. Se permitirá que las muestras se licúen por completo durante 15 a 20 minutos a 37 °C antes de continuar con el procesamiento. Después de la licuefacción completa, el análisis de semen se llevará a cabo utilizando el analizador de calidad de semen automatizado LensHooke™X1 PRO (Bonraybio Co., Ltd) para determinar la concentración y motilidad de esperma, motilidad progresiva (Agarwal et al., 2019). La viabilidad se determinará mediante tinción con eosina-nigrosina si la motilidad es <25%. Los frotis del semen crudo se teñirán con un kit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) para evaluar la morfología del esperma de acuerdo con los estrictos criterios descritos en la guía de la 5.ª edición de la OMS.

Medición de glóbulos blancos Cuando la concentración de glóbulos redondos en el eyaculado es >1 X millón/ml o >5 glóbulos redondos por campo de alta potencia, la muestra se analizará para detectar leucocitospermia, es decir, >1 X millón de glóbulos blancos/ml. Esto será confirmado por la peroxidasa o la prueba de Endtz.

Medición del potencial de reducción de oxidación El ORP mide la transferencia de electrones de un reductor (o antioxidante) a un oxidante. El ORP se mide en milivoltios (mV). En el estudio actual, el ORP se medirá utilizando una nueva tecnología basada en galvanostatos: el sistema MiOXSYS (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Brevemente, se cargarán 30 µL de semen licuado en el sensor MiOXSYS. El sensor se insertará en el analizador MiOXSYS. El ORP estático (sORP), medido en mV, es la medida integrada del equilibrio existente entre oxidantes y reductores totales en un sistema biológico. Los datos se normalizarán con la concentración de espermatozoides. El ORP se expresará como mV/ millón de espermatozoides/mL.

Fragmentación del ADN La fragmentación del ADN se evaluará a través del ensayo de etiquetado de extremo de muesca dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (ensayo TUNEL). Brevemente, 2 millones de espermatozoides se lavarán en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspenderán en paraformaldehído al 3,7 %. Se utilizarán un total de 2 alícuotas (A y B) por cada donante, una para la medida del ORP y otra para la medida de la fragmentación del ADN espermático. Estos se colocarán en hielo durante 30-60 minutos a 4C. A partir de entonces, los espermatozoides se lavarán nuevamente para eliminar el paraformaldehído y luego se volverán a suspender en etanol helado al 70 %, almacenados a -20 °C hasta el momento del análisis.

La fragmentación del ADN espermático se evaluará mediante un ensayo TUNEL con un kit Apo-DirectTM (Pharmingen, San Diego, CA). Se incluirán controles positivos y negativos del kit proporcionados por el fabricante y pruebas positivas preparadas mediante el tratamiento con controles de peróxido de hidrógeno para cada ejecución. Después de un segundo lavado en PBS para eliminar el etanol, los sedimentos de esperma se vuelven a suspender en 50 µl de solución de tinción recién preparada durante 60 minutos a 37 °C. La solución de tinción contiene enzima desoxitransferasa terminal (TdT), tampón de reacción TdT, nucleótidos de trifosfato de desoxiuridina marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dUTP) y agua destilada. Todos los especímenes se lavan más en tampón de enjuague y se vuelven a suspender en 0,5 ml de solución de yoduro de propidio/RNasa, y se incuban durante 30 minutos, seguido de un análisis de citometría de flujo.

Análisis de citometría BD C6 Acuri: todas las señales de fluorescencia de los espermatozoides marcados se analizarán con el citómetro de flujo BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se examinarán alrededor de 10 000 espermatozoides para cada ensayo a una velocidad de flujo lenta de <100 células/seg. La excitación del láser se proporciona a 2 longitudes de onda de 488 nm suministradas por un láser de estado azul sólido a 20 mW y 640 nm alimentado por un láser rojo de diodo de 14,7 mW. La fluorescencia verde (480-530 nm) se mide en el canal FL-1 y la fluorescencia roja (640 nm) en el canal FL-2. El porcentaje de células positivas (TUNEL-positivas) se calculará mediante el software del citómetro de flujo.

Análisis proteómico Las muestras individuales recogidas de cada grupo se someterán a un gradiente de percoll del 65 % para eliminar específicamente los glóbulos blancos. Las muestras de semen se lavarán con PBS tres veces. Una vez que se elimina el sobrenadante, los espermatozoides se solubilizarán en un tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contiene el cóctel inhibidor de proteinasa. Después de la lisis completa de los espermatozoides, se determinará la concentración de proteínas utilizando un kit de ácido bicinconínico (BCA) y se fraccionarán cantidades iguales de proteínas mediante electroforesis en gel SDS-Page 1D. Las bandas separadas se cortarán de un solo gel 1D teñido con azul de Coomassie y se analizarán. Las bandas se lavarán, reducirán, alquilarán y digerirán con tripsina. Los digestos se separarán mediante columna capilar LC-tandem MS y los espectros CID se buscarán en la base de datos de secuencias de referencia humana.

La anotación funcional y el análisis de enriquecimiento se realizarán utilizando herramientas y bases de datos de anotación bioinformática disponibles públicamente, como GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov) y un paquete de software patentado como IPA (Ingenuity Pathway Analysis) de Ingenuity® Systems, utilizado para obtener un contexto funcional integral basado en el consenso para la gran lista de proteínas derivadas de proteínas estudiar. Los datos estarán sujetos a STRING (Herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas que interactúan), una base de datos biológica y un recurso web de interacciones proteína-proteína conocidas y previstas. Esto ayudará a identificar proteínas críticas involucradas en la función reproductiva.

Análisis de datos Todos los datos serán analizados utilizando el software MedCalc (V. 17,8; MedCalc Software, Ostende, Bélgica). Se utilizará la prueba t pareada si la distribución es normal. Mientras que las pruebas de rango con signo de Wilcoxon se utilizarán para parámetros que no siguen una distribución normal. Para comparaciones de pruebas T pareadas basadas en 20 muestras para cada experimento, la potencia debe ser al menos del 90 % para parámetros en los que el coeficiente de variación no supere el 20 %.