Validering af nye enheder mod omgivende elektromagnetisk stråling

Normale raske mænd, der er tilmeldt undersøgelsen, vil blive bedt om at give sædprøver før brug af udstyret. Prøver vil blive produceret med minimum 48-72 timers afholdenhed. Yderligere vil forsøgspersonerne blive blindt tildelt enten sham Qi-Shield eller Qi-Shield enhed og vil blive instrueret i at bruge enheden i en varighed på 8 uger. Sædprøver vil blive leveret af forsøgspersonerne med 0, 4 og 8 ugers interval .

Gruppe 1 forsøgspersoner vil blive forsynet med sham Qi-Shield-enhed, mens gruppe 2-undersøgelsespersoner forsynes med faktisk Qi-Shield-enhed. Hver bruger vil få en lille bæretaske til at rumme enheden under deres rejse. Deltagerne rådes til at holde enheden inden for 3 meters rækkevidde i henhold til producentens instruktioner i en varighed på 8 uger.

Sædanalyse Alle prøver vil blive indsamlet ved onani på Andrologilaboratoriet efter 48-72 timers seksuel afholdenhed. Prøver får lov til at blive fuldstændig flydende i 15-20 minutter ved 37°C før videre behandling. Efter fuldstændig fortætning vil sædanalysen blive udført ved hjælp af automatiseret LensHooke™X1 PRO sædkvalitetsanalysator (Bonraybio Co., Ltd) for at bestemme sædkoncentration og -motilitet, progressiv motilitet (Agarwal et al., 2019). Levedygtigheden vil blive bestemt af Eosin-Nigrosin-farvning, hvis motiliteten er <25%. Udstrygninger af den rå sæd vil blive farvet med et Diff-Quik kit (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) til vurdering af sædmorfologi i henhold til strenge kriterier som beskrevet i WHO, 5. udgave guideline.

Måling af hvide blodlegemer Når koncentrationen af ​​runde celler i ejakulatet er >1 X million/mL eller >5 runde celler pr. højeffektfelt, testes prøven for leukocytospermi, dvs. >1 X million hvide blodlegemer/ml. Dette vil blive bekræftet af peroxidase- eller Endtz-testen.

Måling af oxidationsreduktionspotentiale ORP måler overførslen af ​​elektroner fra en reduktionsmiddel (eller antioxidant) til en oxidant. ORP måles i millivolt (mV). I den nuværende undersøgelse vil ORP blive målt ved hjælp af ny galvanostat-baseret teknologi - MiOXSYS-systemet (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Kort fortalt vil 30 µL flydende sæd blive fyldt på MiOXSYS-sensoren. Sensoren vil blive indsat i MiOXSYS-analysatoren. Statisk ORP (sORP), målt i mV, er det integrerede mål for den eksisterende balance mellem totale oxidanter og reduktanter i et biologisk system. Data vil blive normaliseret med sædkoncentration. ORP vil blive udtrykt som mV/million sperm/mL.

DNA-fragmentering DNA-fragmentering vil blive vurderet via Terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-end-mærkningsassay (TUNEL-assay). Kort fortalt vil 2 millioner spermatozoer blive vasket i phosphatbufret saltvand (PBS) og resuspenderet i 3,7% paraformaldehyd. I alt 2 alikvoter (A og B) vil blive brugt til hver donor, en til ORP-måling og en anden til måling af sæd-DNA-fragmentering. Disse vil blive placeret på is i 30-60 minutter ved 4C. Derefter vil spermatozoerne igen blive vasket for at fjerne paraformaldehydet og derefter resuspenderet i 70% iskold ethanol, opbevaret ved -20°C indtil analysetidspunktet.

Sperm DNA-fragmentering vil blive evalueret ved hjælp af et TUNEL-assay med et Apo-DirectTM-kit (Pharmingen, San Diego, CA). Positive og negative kitkontroller leveret af producenten og positiv test forberedt ved behandling med hydrogenperoxidkontroller vil blive inkluderet for hver kørsel. Efter en anden vask i PBS for at fjerne ethanol, resuspenderes spermpellets i 50 µL frisk fremstillet farvningsopløsning i 60 minutter ved 37C. Farveopløsningen indeholder terminalt deoxytransferase (TdT)-enzym, TdT-reaktionsbuffer, fluorescein-isothiocynat-mærkede deoxyuridintriphosphat-nukleotider (FITC-dUTP) og destilleret vand. Alle prøver vaskes yderligere i skyllebuffer og resuspenderes i 0,5 mL propidiumiodid/RNase-opløsning og inkuberes i 30 minutter efterfulgt af flowcytometrisk analyse.

BD C6 Acuri-cytometrianalyse: Alle fluorescenssignaler fra mærkede spermatozoer vil blive analyseret med flowcytometeret BD Accuri Flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Omkring 10.000 spermatozoer vil blive undersøgt for hvert assay ved en langsom strømningshastighed på <100 celler/sek. Laserexcitationen leveres ved 2 bølgelængder på 488 nm leveret af en solid blue state laser ved 20mW og 640 nm drevet af 14,7mW dioderød laser. Grøn fluorescens (480-530 nm) måles i FL-1-kanalen og rød fluorescens (640 nm) i FL-2-kanalen. Procentdelen af ​​positive celler (TUNEL-positive) vil blive beregnet ved hjælp af flowcytometersoftwaren.

Proteomisk analyse Individuelle prøver indsamlet fra hver gruppe vil blive udsat for 65 % percoll-gradient for specifikt at fjerne de hvide blodlegemer. Sædprøver vil blive vasket med PBS tre gange. Når først supernatanten er fjernet, vil spermatozoer blive solubiliseret i radioimmunpræcipitationsassay (RIPA) lysisbuffer indeholdende proteinaseinhibitorcocktailen. Efter fuldstændig lyse af spermatozoerne vil proteinkoncentrationen blive bestemt ved hjælp af et bicinchoninsyre (BCA) kit, og lige store mængder proteiner vil blive fraktioneret ved hjælp af SDS-Page 1D gelelektroforese. Separerede bånd vil blive skåret fra en enkelt Coomassie blå farvet 1D gel og analyseret. Båndene vil blive vasket, reduceret, alkyleret og fordøjet med trypsin. Fordøjelserne vil blive adskilt af kapillarkolonne LC-tandem MS, og CID-spektrene søges mod den humane referencesekvensdatabase.

Funktionel annoterings- og berigelsesanalyse vil blive udført ved hjælp af offentligt tilgængelige bioinformatiske annoteringsværktøjer og databaser såsom GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov), og proprietær softwarepakke såsom IPA (Ingenuity Pathway Analysis) fra Ingenuity® Systems, der bruges til at opnå konsensusbaseret, omfattende funktionel kontekst for den store liste af proteiner afledt af proteomic undersøgelse. Dataene vil blive underkastet STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), en biologisk database og webressource med kendte og forudsagte protein-protein-interaktioner. Dette vil hjælpe med at identificere kritiske proteiner involveret i reproduktiv funktion.

Dataanalyse Alle data vil blive analyseret ved hjælp af MedCalc-softwaren (V. 17,8; MedCalc Software, Oostende, Belgien). Parret t-test vil blive brugt, hvis fordelingen er normal. Mens Wilcoxon signerede rangtests vil blive brugt til parametre, der ikke følger normalfordelingen. For parrede T-test sammenligninger baseret på 20 prøver for hvert eksperiment, bør effekten være mindst 90 % for parametre, hvor en variationskoefficient ikke er mere end 20 %.