Convalida di nuovi dispositivi contro le radiazioni elettromagnetiche ambientali

Agli uomini sani normali arruolati nello studio verrà chiesto di fornire campioni di sperma prima dell'uso del dispositivo. I campioni saranno prodotti con un minimo di 48-72 ore di astinenza. Inoltre, i soggetti verranno assegnati alla cieca con un finto dispositivo Qi-Shield o Qi-Shield e verranno istruiti a utilizzare il dispositivo per una durata di 8 settimane. I campioni di sperma verranno forniti dai soggetti a intervalli di 0, 4 e 8 settimane .

Ai soggetti dello studio del Gruppo 1 verrà fornito un finto dispositivo Qi-Shield, mentre ai soggetti dello studio del Gruppo 2 verrà fornito un vero dispositivo Qi-Shield. Ad ogni utente verrà fornita una piccola borsa per trasportare il dispositivo durante il viaggio. Si consiglia ai partecipanti di mantenere il dispositivo entro 3 metri di distanza secondo le istruzioni del produttore per una durata di 8 settimane.

Analisi del seme Tutti i campioni saranno prelevati mediante masturbazione presso il Laboratorio di Andrologia dopo 48-72 ore di astinenza sessuale. I campioni saranno lasciati liquefare completamente per 15-20 minuti a 37°C prima dell'ulteriore elaborazione. Dopo la completa liquefazione, l'analisi del seme verrà eseguita utilizzando l'analizzatore automatico della qualità del seme LensHooke™X1 PRO (Bonraybio Co., Ltd) per determinare la concentrazione e la motilità dello sperma, la motilità progressiva (Agarwal et al., 2019). La vitalità sarà determinata mediante colorazione con eosina-nigrosina se la motilità è <25%. Gli strisci del seme crudo saranno colorati con un kit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) per la valutazione della morfologia degli spermatozoi secondo criteri rigorosi come descritto nelle linee guida dell'OMS, 5a edizione.

Misurazione dei globuli bianchi Quando la concentrazione di cellule rotonde nell'eiaculato è >1 X milione/mL o >5 cellule rotonde per campo ad alta potenza, il campione sarà testato per la leucocitospermia, cioè >1 X milione di globuli bianchi/mL. Ciò sarà confermato dalla perossidasi o dal test di Endtz.

Misurazione del potenziale di riduzione dell'ossidazione L'ORP misura il trasferimento di elettroni da un riducente (o antiossidante) a un ossidante. L'ORP è misurato in millivolt (mV). Nel presente studio, l'ORP sarà misurato utilizzando una nuova tecnologia basata su galvanostati: il sistema MiOXSYS (Aytu Bioscience, Englewood, CO). In breve, 30µL di seme liquefatto verranno caricati sul sensore MiOXSYS. Il sensore verrà inserito nell'analizzatore MiOXSYS. L'ORP statico (sORP), misurato in mV, è la misura integrata dell'equilibrio esistente tra ossidanti e riducenti totali in un sistema biologico. I dati saranno normalizzati con la concentrazione di spermatozoi. L'ORP sarà espresso come mV/milione di spermatozoi/mL.

Frammentazione del DNA La frammentazione del DNA sarà valutata mediante test di etichettatura nick-end mediato da dUTP Terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL assay). In breve, 2 milioni di spermatozoi saranno lavati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e risospesi in paraformaldeide al 3.7%. Verranno utilizzate un totale di 2 aliquote (A e B) per ciascun donatore, una per la misurazione dell'ORP e l'altra per la misurazione della frammentazione del DNA spermatico. Questi saranno posti in ghiaccio per 30-60 minuti a 4C. Successivamente, gli spermatozoi saranno nuovamente lavati per rimuovere la paraformaldeide e poi risospesi in etanolo ghiacciato al 70%, conservati a -20°C fino al momento dell'analisi.

La frammentazione del DNA spermatico sarà valutata utilizzando un saggio TUNEL con un kit Apo-DirectTM (Pharmingen, San Diego, CA). I controlli positivi e negativi del kit forniti dal produttore e il test positivo preparato mediante trattamento con controlli di perossido di idrogeno saranno inclusi per ogni corsa. Dopo un secondo lavaggio in PBS per rimuovere l'etanolo, i pellet di spermatozoi vengono risospesi in 50 µL di soluzione colorante appena preparata per 60 minuti a 37°C. La soluzione colorante contiene enzima deossitransferasi terminale (TdT), tampone di reazione TdT, nucleotidi deossiuridina trifosfato marcati con isotiocinato di fluoresceina (FITC-dUTP) e acqua distillata. Tutti i campioni vengono ulteriormente lavati in tampone di risciacquo e risospesi in 0,5 mL di soluzione di ioduro di propidio/RNasi e incubati per 30 minuti seguiti dall'analisi citofluorimetrica.

Analisi citometrica BD C6 Acuri: Tutti i segnali di fluorescenza degli spermatozoi marcati saranno analizzati dal citometro a flusso BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Saranno esaminati circa 10.000 spermatozoi per ciascun test a un flusso lento di <100 cellule/sec. L'eccitazione del laser è fornita a 2 lunghezze d'onda di 488 nm fornite da un laser a stato solido blu a 20 mW e 640 nm alimentato da un laser rosso a diodi da 14,7 mW. La fluorescenza verde (480-530 nm) viene misurata nel canale FL-1 e la fluorescenza rossa (640 nm) nel canale FL-2. La percentuale di cellule positive (TUNEL positive) sarà calcolata utilizzando il software del citometro a flusso.

Analisi proteomica I singoli campioni raccolti da ciascun gruppo saranno sottoposti a un gradiente di percoll del 65% per rimuovere in modo specifico i globuli bianchi. I campioni di seme saranno lavati con PBS tre volte. Una volta rimosso il sopranatante, gli spermatozoi saranno solubilizzati in tampone di lisi con saggio di radio-immunoprecipitazione (RIPA) contenente il cocktail di inibitore della proteinasi. Dopo la completa lisi degli spermatozoi, la concentrazione proteica sarà determinata usando un kit di acido bicinconinico (BCA) e quantità uguali di proteine ​​saranno frazionate usando l'elettroforesi su gel SDS-Page 1D. Bande separate saranno tagliate da un singolo gel 1D colorato con blu di Coomassie e analizzate. Le bande saranno lavate, ridotte, alchilate e digerite con tripsina. I digest saranno separati mediante colonna capillare LC-tandem MS e gli spettri CID saranno confrontati con il database delle sequenze di riferimento umane.

L'annotazione funzionale e l'analisi di arricchimento saranno eseguite utilizzando strumenti e database di annotazione bioinformatica disponibili pubblicamente come GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov) e pacchetto software proprietario come IPA (Ingenuity Pathway Analysis) di Ingenuity® Systems, utilizzato per ottenere un contesto funzionale completo basato sul consenso per l'ampio elenco di proteine ​​derivate dalla proteomica studia. I dati saranno sottoposti a STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), un database biologico e una risorsa web di interazioni proteina-proteina note e previste. Questo aiuterà a identificare le proteine ​​critiche coinvolte nella funzione riproduttiva.

Analisi dei dati Tutti i dati saranno analizzati utilizzando il software MedCalc (V. 17,8; Software MedCalc, Ostenda, Belgio). Verrà utilizzato il t-test accoppiato se la distribuzione è normale. Considerando che, i test dei ranghi firmati di Wilcoxon verranno utilizzati per i parametri che non seguono la distribuzione normale. Per confronti T-test accoppiati basati su 20 campioni per ciascun esperimento, la potenza dovrebbe essere almeno del 90% per i parametri in cui un coefficiente di variazione non è superiore al 20%.