Uusien laitteiden validointi ympäristön sähkömagneettista säteilyä vastaan

Tutkimukseen osallistuvia normaaleja terveitä miehiä pyydetään toimittamaan siemennestenäytteitä ennen laitteen käyttöä. Näytteet tuotetaan vähintään 48–72 tunnin pidättyväisyydellä. Lisäksi koehenkilöille määrätään sokeasti joko vale-Qi-Shield- tai Qi-Shield-laite ja heitä opastetaan käyttämään laitetta 8 viikon ajan. Koehenkilöt toimittavat siemennestenäytteet 0, 4 ja 8 viikon välein. .

Ryhmän 1 koehenkilöt varustetaan vale-Qi-Shield-laitteella, kun taas ryhmän 2 koehenkilöt varsinaisella Qi-Shield-laitteella. Jokainen käyttäjä saa pienen kantolaukun, johon laite mahtuu matkan aikana. Osallistujia kehotetaan pitämään laitetta 3 metrin säteellä valmistajan ohjeiden mukaisesti 8 viikon ajan.

Siemennesteanalyysi Kaikki näytteet kerätään masturbaatiolla Andrologian laboratoriossa 48-72 tunnin seksuaalisen pidättymisen jälkeen. Näytteiden annetaan nesteytyä kokonaan 15-20 minuuttia 37 C:ssa ennen jatkokäsittelyä. Täydellisen nesteyttämisen jälkeen siemennesteanalyysi suoritetaan käyttämällä automatisoitua LensHooke™X1 PRO siemennesteen laatuanalysaattoria (Bonraybio Co., Ltd) siittiöiden pitoisuuden ja liikkuvuuden sekä progressiivisen liikkuvuuden määrittämiseksi (Agarwal et al., 2019). Elinkelpoisuus määritetään Eosin-Nigrosin-värjäyksellä, jos liikkuvuus on <25 %. Raaka siemennesteen siivut värjätään Diff-Quik-kitillä (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) siittiöiden morfologian arvioimiseksi tiukkojen kriteerien mukaisesti, kuten WHO:n 5. painoksen ohjeissa on kuvattu.

Valkosolujen mittaus Kun pyöreän solun pitoisuus ejakulaatissa on > 1 X miljoonaa/ml tai > 5 pyöreää solua suurtehokenttää kohden, näytteestä testataan leukosytospermia, eli > 1 X miljoonaa valkosolua/ml. Tämä varmistetaan peroksidaasilla tai Endtz-testillä.

Hapettumisen pelkistyspotentiaalin mittaaminen ORP mittaa elektronien siirtymistä pelkistimestä (tai antioksidantista) hapettimeen. ORP mitataan millivolteina (mV). Tässä tutkimuksessa ORP:tä mitataan käyttämällä uutta galvanostaattipohjaista teknologiaa - MiOXSYS System -järjestelmää (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Lyhyesti sanottuna 30 µl nesteytettyä siemennestettä ladataan MiOXSYS-anturiin. Anturi asetetaan MiOXSYS-analysaattoriin. Staattinen ORP (sORP), mitattuna mV, on integroitu mitta hapettimien ja pelkistimien kokonaismäärän välillä biologisessa järjestelmässä. Tiedot normalisoidaan siittiöiden pitoisuudella. ORP ilmaistaan ​​mV/miljoonaa siittiötä/ml.

DNA-fragmentaatio DNA-fragmentaatio arvioidaan terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasivälitteisen dUTP-nick-pään leimausmäärityksellä (TUNEL-määritys). Lyhyesti sanottuna 2 miljoonaa siittiötä pestään fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja suspendoidaan uudelleen 3,7-prosenttiseen paraformaldehydiin. Jokaiselle luovuttajalle käytetään yhteensä 2 alikvoottia (A ja B), yksi ORP-mittaukseen ja toinen siittiöiden DNA-fragmentaation mittaamiseen. Nämä asetetaan jäälle 30-60 minuutiksi 4 C:een. Sen jälkeen siittiöt pestään uudelleen paraformaldehydin poistamiseksi ja suspendoidaan sitten uudelleen 70-prosenttiseen jääkylmään etanoliin, säilytetään -20 °C:ssa analyysiin asti.

Sperman DNA-fragmentaatio arvioidaan käyttämällä TUNEL-määritystä Apo-DirectTM-sarjan kanssa (Pharmingen, San Diego, CA). Valmistajan toimittamat positiiviset ja negatiiviset pakkauksen kontrollit ja vetyperoksidikäsittelyllä valmistettu positiivinen testi sisältyvät jokaiseen ajoon. Toisen PBS-pesun jälkeen etanolin poistamiseksi siittiöpelletit suspendoidaan uudelleen 50 ul:aan juuri valmistettua värjäysliuosta 60 minuutin ajan 37 °C:ssa. Värjäysliuos sisältää terminaalista deoksitransferaasientsyymiä (TdT), TdT-reaktiopuskuria, fluoreseiini-isotiosynaattileimattuja deoksiuridiinitrifosfaattinukleotideja (FITC-dUTP) ja tislattua vettä. Kaikki näytteet pestään edelleen huuhtelupuskurissa ja suspendoidaan uudelleen 0,5 ml:aan propidiumjodidi/RNaasi-liuosta ja inkuboidaan 30 minuuttia, minkä jälkeen suoritetaan virtaussytometrinen analyysi.

BD C6 Acuri -sytometriaanalyysi: Kaikki leimattujen siittiöiden fluoresenssisignaalit analysoidaan virtaussytometrillä BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Noin 10 000 siittiötä tutkitaan jokaisessa määrityksessä hitaalla virtausnopeudella <100 solua/s. Laserviritys saadaan aikaan kahdella 488 nm:n aallonpituudella 20 mW:n ja 640 nm:n puolijohdelaserin toimittamana 14,7 mW:n punaisen diodilaserin avulla. Vihreä fluoresenssi (480-530 nm) mitataan FL-1-kanavassa ja punainen fluoresenssi (640 nm) FL-2-kanavassa. Positiivisten solujen (TUNEL-positiivisten) prosenttiosuus lasketaan käyttämällä virtaussytometriohjelmistoa.

Proteominen analyysi Kustakin ryhmästä kerätyt yksittäiset näytteet altistetaan 65 %:n perkolligradientille valkoisten verisolujen poistamiseksi. Siemennestenäytteet pestään PBS:llä kolme kertaa. Kun supernatantti on poistettu, siittiöt liuotetaan radioimmunosaostusmäärityksen (RIPA) lyysipuskuriin, joka sisältää proteinaasi-inhibiittoriseoksen. Siittiöiden täydellisen hajoamisen jälkeen proteiinipitoisuus määritetään käyttämällä bikinkoniinihappopakkausta (BCA) ja yhtä suuret määrät proteiineja fraktioidaan käyttämällä SDS-Page 1D -geelielektroforeesia. Erotetut juovat leikataan yhdestä Coomassie Blue -värjätystä 1D-geelistä ja analysoidaan. Nauhat pestään, pelkistetään, alkyloidaan ja pilkotaan trypsiinillä. Digestiot erotetaan kapillaarikolonnilla LC-tandem MS ja CID-spektrit haetaan ihmisen vertailusekvenssitietokantaa vasten.

Toiminnallinen merkintä- ja rikastusanalyysi suoritetaan käyttämällä julkisesti saatavilla olevia bioinformatiikan merkintätyökaluja ja tietokantoja, kuten GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), tietokanta merkintöjä, visualisointia ja integroitua etsintää (DAVID) varten. (http://david.niaid.nih.gov) ja patentoitu ohjelmistopaketti, kuten Ingenuity® Systemsin IPA (Ingenuity Pathway Analysis), jota käytetään konsensuspohjaisen, kattavan toiminnallisen kontekstin saamiseksi laajalle proteomicista johdettujen proteiinien luettelolle. opiskella. Tiedot käsitellään STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), biologinen tietokanta ja verkkoresurssi tunnetuista ja ennustetuista proteiini-proteiinivuorovaikutuksista. Tämä auttaa tunnistamaan kriittiset proteiinit, jotka osallistuvat lisääntymistoimintoihin.

Tietojen analysointi Kaikki tiedot analysoidaan käyttämällä MedCalc-ohjelmistoa (V. 17,8; MedCalc Software, Oostende, Belgia). Parillista t-testiä käytetään, jos jakauma on normaali. Sen sijaan Wilcoxon-merkittyjä arvotestejä käytetään parametreille, jotka eivät noudata normaalijakaumaa. Parillisissa T-testivertailuissa, jotka perustuvat 20 näytteeseen kussakin kokeessa, tehon tulisi olla vähintään 90 % parametreille, joiden variaatiokerroin on enintään 20 %.