Walidacja nowych urządzeń pod kątem promieniowania elektromagnetycznego otoczenia

Normalni zdrowi mężczyźni włączeni do badania zostaną poproszeni o dostarczenie próbek nasienia przed użyciem urządzenia. Próbki zostaną wyprodukowane po minimum 48-72 godzinach abstynencji. Ponadto badani zostaną na ślepo przydzieleni do pozorowanego urządzenia Qi-Shield lub Qi-Shield i zostaną poinstruowani, jak używać urządzenia przez okres 8 tygodni. Próbki nasienia będą dostarczane przez pacjentów w odstępach 0, 4 i 8 tygodni .

Osoby badane z grupy 1 otrzymają fałszywe urządzenie Qi-Shield, natomiast osoby z grupy 2 otrzymają rzeczywiste urządzenie Qi-Shield. Każdy użytkownik otrzyma małą torbę transportową, w której zmieści urządzenie podczas podróży. Uczestnikom zaleca się trzymanie urządzenia w zasięgu 3 metrów zgodnie z instrukcjami producenta przez okres 8 tygodni.

Analiza nasienia Wszystkie próbki zostaną pobrane przez masturbację w Pracowni Andrologicznej po 48-72 godzinach abstynencji seksualnej. Próbki zostaną pozostawione do całkowitego upłynnienia na 15-20 minut w temperaturze 37°C przed dalszym przetwarzaniem. Po całkowitym upłynnieniu zostanie przeprowadzona analiza nasienia przy użyciu automatycznego analizatora jakości nasienia LensHooke™X1 PRO (Bonraybio Co., Ltd) w celu określenia stężenia i ruchliwości plemników, ruchliwości progresywnej (Agarwal i in., 2019). Żywotność zostanie określona przez barwienie eozyną-nigrozyną, jeśli ruchliwość wynosi <25%. Rozmazy surowego nasienia zostaną wybarwione zestawem Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) w celu oceny morfologii plemników według ścisłych kryteriów opisanych w wytycznych WHO, wydanie 5.

Pomiar krwinek białych Gdy stężenie krwinek okrągłych w ejakulacie wynosi >1 X milionów/ml lub >5 komórek okrągłych na pole o dużej mocy, próbka zostanie zbadana pod kątem leukocytospermii, tj. >1 X milionów białych krwinek/ml. Potwierdzi to peroksydaza lub test Endtza.

Pomiar potencjału utleniania-redukcji ORP mierzy transfer elektronów z reduktora (lub przeciwutleniacza) do utleniacza. ORP mierzy się w miliwoltach (mV). W bieżącym badaniu ORP będzie mierzone przy użyciu nowatorskiej technologii opartej na galwanostacie - systemu MiOXSYS (Aytu Bioscience, Englewood, CO). W skrócie, 30 µl upłynnionego nasienia zostanie załadowane na czujnik MiOXSYS. Czujnik zostanie umieszczony w analizatorze MiOXSYS. Statyczny ORP (sORP), mierzony w mV, jest zintegrowaną miarą istniejącej równowagi między całkowitą ilością utleniaczy i reduktorów w systemie biologicznym. Dane zostaną znormalizowane ze stężeniem plemników. ORP będzie wyrażone jako mV/mln plemników/ml.

Fragmentacja DNA Fragmentacja DNA zostanie oceniona za pomocą testu znakowania nick-end dUTP, w którym pośredniczy transferaza terminalnej dezoksynukleotydylu (test TUNEL). Pokrótce, 2 miliony plemników zostanie przemytych w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawieszone w 3,7% paraformaldehydzie. W sumie 2 porcje (A i B) zostaną użyte dla każdego dawcy, jedna do pomiaru ORP, a druga do pomiaru fragmentacji DNA plemników. Zostaną one umieszczone na lodzie na 30-60 minut w temperaturze 4°C. Następnie plemniki zostaną ponownie przemyte w celu usunięcia paraformaldehydu, a następnie ponownie zawieszone w 70% lodowatym etanolu, przechowywane w temperaturze -20°C do czasu analizy.

Fragmentacja DNA plemników zostanie oceniona przy użyciu testu TUNEL z zestawem Apo-DirectTM (Pharmingen, San Diego, CA). Pozytywne i ujemne kontrole zestawu dostarczone przez producenta oraz pozytywne testy przygotowane przez potraktowanie nadtlenkiem wodoru będą dołączone do każdej serii. Po drugim przemyciu w PBS w celu usunięcia etanolu, osady plemników ponownie zawiesza się w 50 µl świeżo przygotowanego roztworu barwiącego na 60 minut w temperaturze 37°C. Roztwór barwiący zawiera terminalną dezoksytransferazę (TdT), bufor reakcyjny TdT, znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny nukleotydy trifosforanu dezoksyurydyny (FITC-dUTP) i wodę destylowaną. Wszystkie próbki następnie przemywa się buforem do płukania i ponownie zawiesza w 0,5 ml roztworu jodku propidyny/RNazy i inkubuje przez 30 minut, po czym przeprowadza analizę metodą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna BD C6 Acuri: Wszystkie sygnały fluorescencji znakowanych plemników będą analizowane za pomocą cytometru przepływowego BD Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). W każdym teście zostanie przebadanych około 10 000 plemników przy powolnym przepływie <100 komórek/sek. Wzbudzenie lasera jest zapewnione przy 2 długościach fali 488 nm, dostarczanych przez stały laser niebieski o mocy 20 mW i 640 nm zasilanych czerwonym laserem diodowym 14,7 mW. Zielona fluorescencja (480-530 nm) jest mierzona w kanale FL-1, a czerwona fluorescencja (640 nm) w kanale FL-2. Procent komórek dodatnich (TUNEL-dodatnich) zostanie obliczony przy użyciu oprogramowania cytometru przepływowego.

Analiza proteomiczna Poszczególne próbki pobrane z każdej grupy zostaną poddane działaniu 65% gradientu perkolu w celu specyficznego usunięcia białych krwinek. Próbki nasienia zostaną trzykrotnie przemyte PBS. Po usunięciu supernatantu plemniki zostaną rozpuszczone w buforze do lizy do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) zawierającym koktajl inhibitorów proteinazy. Po całkowitej lizie plemników stężenie białka zostanie określone przy użyciu zestawu kwasu bicynchoninowego (BCA) i równe ilości białek zostaną frakcjonowane przy użyciu elektroforezy żelowej SDS-Page 1D. Oddzielone prążki zostaną wycięte z pojedynczego żelu 1D barwionego błękitem Coomassie i poddane analizie. Prążki zostaną przemyte, zredukowane, alkilowane i strawione trypsyną. Produkty trawienia zostaną rozdzielone na kolumnie kapilarnej LC-tandem MS, a widma CID przeszukane w bazie danych ludzkich sekwencji referencyjnych.

Analiza adnotacji funkcjonalnych i wzbogacania zostanie przeprowadzona przy użyciu publicznie dostępnych narzędzi bioinformatycznych i baz danych, takich jak GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov) oraz zastrzeżony pakiet oprogramowania, taki jak IPA (Ingenuity Pathway Analysis) firmy Ingenuity® Systems, używany do uzyskiwania opartego na konsensusie, kompleksowego kontekstu funkcjonalnego dla dużej listy białek pochodzących z badań proteomicznych badanie. Dane zostaną przekazane do STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Gens/Proteins), biologicznej bazy danych i internetowego zasobu znanych i przewidywanych interakcji białko-białko. Pomoże to w identyfikacji krytycznych białek zaangażowanych w funkcje reprodukcyjne.

Analiza danych Wszystkie dane zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania MedCalc (V. 17,8; MedCalc Software, Ostenda, Belgia). Sparowany test t zostanie zastosowany, jeśli rozkład jest normalny. Natomiast testy rang ze znakiem Wilcoxona będą stosowane dla parametrów, które nie mają rozkładu normalnego. W przypadku porównań sparowanych testów t opartych na 20 próbkach dla każdego eksperymentu moc powinna wynosić co najmniej 90% dla parametrów, w których współczynnik zmienności nie przekracza 20%.