Validering av nya enheter mot omgivande elektromagnetisk strålning

Normala friska män som är inskrivna i studien kommer att bli ombedda att tillhandahålla spermaprover innan apparaten används. Prover kommer att produceras med minst 48-72 timmars avhållsamhet. Vidare kommer försökspersonerna blint tilldelas antingen sken-Qi-Shield- eller Qi-Shield-enhet och kommer att instrueras att använda enheten under en varaktighet av 8 veckor. Spermaprover kommer att tillhandahållas av försökspersonerna med 0, 4 och 8 veckors intervall .

Försökspersoner i grupp 1 kommer att förses med en falsk Qi-Shield-enhet, medan grupp 2-studiepersoner förses med en faktisk Qi-Shield-enhet. Varje användare kommer att förses med en liten bärväska för att rymma enheten under sin resa. Deltagarna rekommenderas att hålla enheten inom 3 meters räckvidd enligt tillverkarens instruktioner under en varaktighet på 8 veckor.

Spermaanalys Alla prover kommer att tas genom onani på Andrologilaboratoriet efter 48-72 timmars sexuell avhållsamhet. Proverna kommer att tillåtas att smälta helt i 15-20 minuter vid 37C innan vidare bearbetning. Efter fullständig flytning kommer spermaanalys att utföras med en automatiserad LensHooke™X1 PRO spermakvalitetsanalysator (Bonraybio Co., Ltd) för att bestämma spermiekoncentration och rörlighet, progressiv motilitet (Agarwal et al., 2019). Viabiliteten kommer att bestämmas av Eosin-Nigrosin-färgning om motiliteten är <25 %. Utstryk av den råa sperman kommer att färgas med ett Diff-Quik-kit (Baxter Healthcare Corporation, Inc., McGaw Park, IL) för bedömning av spermamorfologi enligt strikta kriterier som beskrivs i WHO:s riktlinjer för 5:e upplagan.

Mätning av vita blodkroppar När koncentrationen av runda blodkroppar i ejakulatet är >1 X miljon/mL eller >5 runda celler per högeffektfält, kommer provet att testas för leukocytospermi, dvs >1 X miljon vita blodkroppar/ml. Detta kommer att bekräftas av peroxidaset eller Endtz-testet.

Mätning av oxidationsreduktionspotential ORP mäter överföringen av elektroner från en reduktionsmedel (eller antioxidant) till en oxidant. ORP mäts i millivolt (mV). I den aktuella studien kommer ORP att mätas med hjälp av ny galvanostatbaserad teknologi - MiOXSYS-systemet (Aytu Bioscience, Englewood, CO). Kortfattat kommer 30 µL flytande sperma att laddas på MiOXSYS-sensorn. Sensorn kommer att sättas in i MiOXSYS-analysatorn. Statisk ORP (sORP), mätt i mV, är det integrerade måttet på den existerande balansen mellan totala oxidanter och reduktanter i ett biologiskt system. Data kommer att normaliseras med spermiekoncentration. ORP kommer att uttryckas som mV/miljon spermier/ml.

DNA-fragmentering DNA-fragmentering kommer att bedömas via terminal deoxinukleotidyltransferas-medierad dUTP nick-end-märkningsanalys (TUNEL-analys). Kortfattat kommer 2 miljoner spermier att tvättas i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och återsuspenderas i 3,7 % paraformaldehyd. Totalt 2 alikvoter (A och B) kommer att användas för varje donator, en för ORP-mätning och en annan för mätning av spermie-DNA-fragmentering. Dessa kommer att placeras på is i 30-60 minuter vid 4C. Därefter kommer spermierna att tvättas igen för att avlägsna paraformaldehyden och sedan återsuspenderas i 70 % iskall etanol, lagrad vid -20°C fram till analystillfället.

Spermie-DNA-fragmentering kommer att utvärderas med en TUNEL-analys med ett Apo-DirectTM-kit (Pharmingen, San Diego, CA). Positiva och negativa kitkontroller tillhandahållna av tillverkaren och positiva test som framställts genom behandling med väteperoxidkontroller kommer att inkluderas för varje körning. Efter en andra tvätt i PBS för att avlägsna etanol, återsuspenderas spermiepelletsen i 50 µL nyberedd färgningslösning i 60 minuter vid 37°C. Färgningslösningen innehåller terminalt deoxitransferas (TdT)-enzym, TdT-reaktionsbuffert, fluoresceinisotiocynatmärkta deoxiuridintrifosfatnukleotider (FITC-dUTP) och destillerat vatten. Alla prover tvättas ytterligare i sköljbuffert och återsuspenderas i 0,5 mL propidiumjodid/RNas-lösning och inkuberas i 30 minuter följt av flödescytometrisk analys.

BD C6 Acuri-cytometrianalys: Alla fluorescenssignaler från märkta spermier kommer att analyseras med flödescytometern BD Accuri Flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Cirka 10 000 spermier kommer att undersökas för varje analys vid en långsam flödeshastighet på <100 celler/sek. Laserexciteringen tillhandahålls vid 2 våglängder på 488 nm som tillhandahålls av en solid blue state-laser vid 20mW och 640 nm som drivs av 14,7mW diodröd laser. Grön fluorescens (480-530 nm) mäts i FL-1-kanalen och röd fluorescens (640 nm) i FL-2-kanalen. Procentandelen positiva celler (TUNEL-positiva) kommer att beräknas med hjälp av flödescytometerns programvara.

Proteomisk analys Individuella prover som samlas in från varje grupp kommer att utsättas för 65 % percoll-gradient för att specifikt ta bort de vita blodkropparna. Spermaprover kommer att tvättas med PBS tre gånger. När supernatanten väl har tagits bort kommer spermier att solubiliseras i radio-immunoprecipitationsanalys (RIPA) lysbuffert innehållande proteinashämmarcocktailen. Efter fullständig lysering av spermatozoerna kommer proteinkoncentrationen att bestämmas med hjälp av ett kit med bicinchoninsyra (BCA) och lika mängder proteiner kommer att fraktioneras med SDS-Page 1D gelelektrofores. Separerade band kommer att skäras från en enda Coomassie-blåfärgad 1D-gel och analyseras. Banden kommer att tvättas, reduceras, alkyleras och smälts med trypsin. Digesterna kommer att separeras av kapillärkolonn LC-tandem MS och CID-spektra söks mot den mänskliga referenssekvensdatabasen.

Funktionell annotering och anrikningsanalys kommer att utföras med hjälp av allmänt tillgängliga bioinformatiska annoteringsverktyg och databaser som GO Term Finder, GO Term Mapper, UniProt, Software Tools for Researching Annotations of Proteins (STRAP), Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.niaid.nih.gov), och proprietärt mjukvarupaket som IPA (Ingenuity Pathway Analysis) från Ingenuity® Systems, som används för att erhålla konsensusbaserade, omfattande funktionella sammanhang för den stora listan av proteiner som härrör från proteomic studie. Data kommer att utsättas för STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), en biologisk databas och webbresurs med kända och förutspådda protein-protein-interaktioner. Detta kommer att hjälpa till att identifiera kritiska proteiner som är involverade i reproduktiv funktion.

Dataanalys All data kommer att analyseras med hjälp av MedCalc Software (V. 17,8; MedCalc Software, Oostende, Belgien). Parat t-test kommer att användas om fördelningen är normal. Medan Wilcoxon signerade ranktest kommer att användas för parametrar som inte följer normalfördelning. För parade T-testjämförelser baserade på 20 prover för varje experiment, bör effekten vara minst 90 % för parametrar där en variationskoefficient inte är mer än 20 %.