浸潤性疾患の組織モデル (TIMID) (TIMID)

これは前臨床研究プロジェクトであり、患者の介入は計画されていません。 このプロジェクトは、根治手術中に廃棄された匿名化されたヒト組織サンプルを利用しています。 このプロジェクトに含まれる脾臓サンプルは、レスター総合病院の HPB ユニットで膵臓の病変に対する待機手術を受けている患者からのものです。 24個の脾臓のサンプルサイズは、累乗計算によって決定されており、過去数年間の選択的膵臓手術によって実際に摘出された脾臓の数と一致しています. この研究およびサンプルの使用から、外科的処置または募集結果に変化はありません。 脾臓サンプルで行われたすべての実験作業は、患者に影響を与えません。

実験には、ex vivo 臓器灌流および細菌またはウイルスによる感染が含まれます。 灌流された 24 個の脾臓の生検は、in vitro 組織切片およびマクロファージ細胞培養のために処理されます。 得られた初代細胞培養物と組織切片は、将来の研究のために凍結保存されます。 24 の臓器、およびそれらに由来する組織と細胞に関するすべての in vitro 研究では、侵襲性細菌またはウイルスを除去する脾臓細胞の能力に対する治療的介入 (抗体、受容体拮抗薬、抗生物質、およびその他の分子) の効果を評価します。 実験は、脾臓サンプルが利用可能になるたびに実行されます。

ヒト組織の保存と廃棄のための戦略を含む実験戦略の詳細な技術的説明は次のとおりです。

1. 全器官のエクスビボ灌流: この作業は、器官を安定させ、器官に感染させ、そこから初代細胞培養用の組織切片と細胞を抽出するために行われます。 我々 は正常体温 ex vivo 豚脾臓灌流モデルを設定しました。 この専門知識により、最大 6 時間のブタ脾臓の臓器収集、輸送、および灌流のパラメーターを定義し、重要なことに感染モデルを開発することができました。 感染は、血液から細菌を除去する能力と良好な濾過能力の保存を示し、このアプリケーションに不可欠であり、臓器モデル全体でもマクロファージの特定のサブセットが細菌の細胞内複製を許容することを示しました。 この実験シリーズでは、移植されたヒト脾臓全体を灌流することを提案します。 ブタとは対照的に、獲得免疫を中和または最小化するために、ヒト臓器合成培地の灌流に使用します。 組織学、共焦点顕微鏡、FACS 分析、細菌およびウイルスの列挙は、灌流器官を分析するための主な方法論になります。 作業のこの部分の目的は、臓器全体のレベルで細菌とウイルスが脾臓組織マクロファージで複製できることを実証することであり、侵襲性細菌およびウイルス疾患を潜在的に予防するこれらの初期段階の予防に抗感染治療の注意を向けることです。 24 の全灌流器官からのサンプルは、組織切片培養および初代細胞培養のソースになります。
2. 一次細胞培養: 24 個のヒト脾臓から、ヒト組織マクロファージおよびその他の免疫細胞の一次培養用のサンプルを抽出します。 マウスとブタの細胞に使用されている方法論を使用して、ヒト脾臓免疫細胞、特にマクロファージの初代培養をセットアップします。 マクロファージや好中球を含む免疫細胞は、パーコール勾配遠心分離、FACS、磁気分離などのさまざまな方法で精製され、最大 7 日間培養されます。 培養物は、サイトカイン、表面マーカー、誰でも生産、遺伝子発現を含む複数のパラメーターについてテストされます。 細菌またはウイルスとの相互作用をテストするために、培養細胞は細菌およびウイルス病原体のパネルに感染します。 他の方法論では、共焦点顕微鏡、FACS、および RNAseq を使用して、細菌およびウイルスの病原体と宿主細胞の挙動を監視します。 システムの扱いやすさをテストするために、サイトカイン、ケモカイン、薬物、抗生物質、およびその他の化合物による介入が行われます。 介入の標的を特定することを念頭に置いて、細胞培養モデルは、制御されたインビトロ培養システムにおける特定の組織マクロファージにおける細菌またはウイルスと免疫細胞の相互作用の詳細な定量化可能なパラメーターを提供することを目的としています。 これは、浸潤性疾患の開始を変更する戦略をテストするミディアム スループット アッセイの設計を許可することを目的としています。 細胞は、さらなる研究のために液体窒素で保存されます。
3. 器官型スライス培養: 24 個のヒト脾臓から、細胞に加えて、器官型スライス培養用の組織サンプルも取得します。 方法論が脳スライス用に適切に設定され、脾臓について説明されているので、器官型ヒト脾臓スライス培養を培養します。 これらの器官スライスは、組織マクロファージを分析する際に特に重要な器官の多細胞空間マイクロアーキテクチャを維持するため、細胞培養よりも優れています。 脳スライス培養に関しては、スライスに細菌またはウイルス病原体を感染させ、組織内でのそれらの移動、細胞の感染、および単一宿主細胞の反応を監視します。 組織スライス培養の使用により、マクロファージを含む免疫細胞の特定のサブセットのターゲティングおよび複製許容の性質を具体的に研究できるようになります。 目的の目標は、感染した脾臓スライスのタイムラップ共焦点顕微鏡を含む脾臓の感染病巣の詳細な開発を可能にすることです。 このモデルでのサイトカインおよび他の宿主由来分子の試験は、マクロファージを含む免疫細胞の特定のサブセットを標的とする介入の可能性を示すことが期待されています。 組織切片は、さらなる研究のために液体窒素で保存されます。

ユニット間のサンプル転送: 計画された 24 の臓器灌流は、レスター総合病院の HBP ユニットの検査室で行われます。 場合によっては、レスター大学の遺伝学およびゲノム生物学科で臓器灌流が行われることがあります。 相対的な HBA フォームが取得されました (有害な生物学的エージェント フォーム GEN/45 細胞株および初代ヒト細胞および組織培養、日付 02/10/2017)。 灌流中および灌流後、組織切片培養および初代細胞培養用の組織サンプルを採取します。 これらの組織サンプルは、予定されている研究作業のために遺伝学およびゲノム生物学の部門または感染および免疫および炎症の部門に転送され、ヒト組織法に関連する規制に従ってそこで保管されます。 保存された組織切片と初代細胞培養物は、免疫学的研究のためにノッティンガム大学に移され、細胞培養物について上記で詳述した実験作業が行われます。 取り扱い、保管、および輸送の条件は、HBA フォーム GEN45 によって定義され、転送は MTA によって規制されます。