Modelos de tejido para enfermedades invasivas (TIMID) (TIMID)

Este es un proyecto de investigación preclínica y no está prevista ninguna intervención del paciente. El proyecto utiliza muestras anonimizadas de tejido humano descartadas durante una cirugía radical. Las muestras de órganos de bazo incluidas en este proyecto serán de pacientes sometidos a cirugía electiva por una lesión en el páncreas en la Unidad HPB del Hospital General de Leicester. El tamaño de la muestra de 24 bazos se ha determinado mediante cálculos de potencia y está en consonancia con el número de bazos realmente extirpados mediante cirugía de páncreas electiva en los últimos años. Ningún cambio en el procedimiento quirúrgico o los resultados de reclutamiento de este estudio y el uso de las muestras. Todo el trabajo experimental realizado en las muestras de bazo no tendrá ningún efecto sobre el paciente.

Los experimentos incluyen la perfusión de órganos ex vivo y la infección con bacterias o virus. Las biopsias de los 24 bazos perfundidos se procesan para el corte de tejido in vitro y el cultivo de células de macrófagos. Los cultivos de células primarias resultantes y los cortes de tejido se almacenarán congelados para futuras investigaciones. Todos los estudios in vitro sobre los 24 órganos y los tejidos y células derivados de ellos evaluarán el efecto de las intervenciones terapéuticas (anticuerpos, antagonistas de receptores, antibióticos y otras moléculas) sobre la capacidad de las células esplénicas para eliminar bacterias o virus invasivos. Los experimentos se realizarán cada vez que se disponga de una muestra de bazo.

La descripción técnica detallada de la estrategia experimental, incluida la estrategia de almacenamiento y descarte del tejido humano, será la siguiente:

1. Perfusión ex vivo de todo el órgano: este trabajo se realiza para estabilizar el órgano, infectarlo y luego derivar de él cortes de tejido y células para el cultivo celular primario. Hemos establecido con éxito un modelo de perfusión de bazo porcino ex vivo normotérmico. Esta experiencia nos permitió definir los parámetros para la recolección, el transporte y la perfusión de órganos de bazos porcinos durante un máximo de seis horas y, lo que es más importante, desarrollar un modelo de infección. La infección mostró conservación de la capacidad para eliminar bacterias de la sangre y una buena capacidad de filtración y, esencial para esta aplicación, que también en el modelo de órgano completo, subconjuntos específicos de macrófagos son permisivos para la replicación intracelular bacteriana. En esta serie experimental proponemos perfundir bazos humanos explantados enteros. A diferencia de los cerdos, utilizaremos para la perfusión del órgano humano medio sintético con el fin de neutralizar o minimizar la inmunidad adquirida. Histología, microscopía confocal, análisis FACS y enumeración bacteriana y viral serán las principales metodologías para analizar el órgano perfundido. El objetivo de esta parte del trabajo es demostrar que, a nivel de todo el órgano, las bacterias y los virus pueden replicarse en los macrófagos del tejido esplénico, señalando la atención de los tratamientos antiinfecciosos para la prevención de estos primeros pasos, lo que podría prevenir enfermedades bacterianas y virales invasivas. Las muestras de los 24 órganos perfundidos completos serán la fuente de cultivos de cortes de tejido y cultivos de células primarias.
2. Cultivos celulares primarios: De los 24 bazos humanos obtendremos muestras para el cultivo primario de macrófagos de tejidos humanos y otras células inmunitarias. Usando la metodología en uso para células de ratones y cerdos, estableceremos cultivos primarios de células inmunes esplénicas humanas y, en particular, macrófagos. Las células inmunitarias, incluidos los macrófagos y los neutrófilos, se purificarán mediante diferentes metodologías, incluida la centrifugación en gradiente de percoll, FACS y separación magnética, y se cultivarán durante un máximo de siete días. Los cultivos se analizarán para múltiples parámetros, incluidas las citoquinas, los marcadores de superficie, la producción de cualquiera y la expresión génica. Para probar la interacción con bacterias o virus, las células cultivadas se infectarán con un panel de patógenos bacterianos y virales. Sobre otra metodología, se utilizará microscopía confocal, FACS y RNAseq para monitorear el comportamiento de patógenos bacterianos y virales y células huésped. Se llevarán a cabo intervenciones con citocinas, quimiocinas, fármacos, antibióticos y otros compuestos para probar la manejabilidad del sistema. Con el objetivo de identificar objetivos para la intervención, los modelos de cultivo celular están destinados a proporcionar parámetros cuantificables detallados de la interacción de bacterias o virus y células inmunitarias, en particular macrófagos tisulares, en un sistema de cultivo in vitro controlado. Esto tiene como objetivo permitir el diseño de ensayos de rendimiento medio para probar estrategias que modifican el inicio de la enfermedad invasiva. Las células se almacenarán en nitrógeno líquido para futuras investigaciones.
3. Cultivos de cortes organotípicos: De los 24 bazos humanos obtendremos, además de células, también muestras de tejido para cultivos de cortes organotípicos. Con la metodología bien establecida para los cortes de cerebro y descrita para el bazo, cultivaremos cultivos organotípicos de cortes de bazo humano. Estos cortes de órganos son superiores a los cultivos celulares, ya que mantienen la microarquitectura espacial multicelular del órgano, lo que es especialmente importante cuando se analizan macrófagos tisulares. En cuanto a los cultivos de cortes de cerebro, infectaremos los cortes con patógenos bacterianos o virales y controlaremos su migración dentro del tejido, la infección de las células y la reacción de las células huésped individuales. El uso del cultivo de cortes de tejido debería permitir estudiar específicamente la orientación y la naturaleza permisiva de la replicación de subconjuntos específicos de células inmunitarias, incluidos los macrófagos. Un objetivo del objetivo es permitir el desarrollo detallado de focos infecciosos en el bazo, incluida la microscopía confocal de intervalos de tiempo de cortes de bazo infectados. Se espera que las pruebas en este modelo de citocinas y otras moléculas derivadas del huésped muestren el potencial de las intervenciones dirigidas a subconjuntos específicos de células inmunitarias, incluidos los macrófagos. Las rebanadas de tejido se almacenarán en nitrógeno líquido para futuras investigaciones.

Transferencia de muestras entre unidades: Las 24 perfusiones de órganos previstas se realizarán en los laboratorios de la unidad de HTA del Leicester General Hospital. En casos seleccionados, la perfusión de órganos puede realizarse en el Departamento de Genética y Biología del Genoma de la Universidad de Leicester. Se ha obtenido el formulario HBA relativo (Formulario de agentes biológicos peligrosos GEN/45 Líneas celulares y cultivo primario de células y tejidos humanos, fecha 10/02/2017). Durante y después de la perfusión, se tomarán muestras de tejido para cultivo de cortes de tejido y cultivo celular primario. Estas muestras de tejido serán trasladadas al Departamento de Genética y Biología del Genoma o al Departamento de Infección e Inmunidad e Inflamación para los trabajos de investigación programados y serán almacenadas allí de acuerdo con las normas relativas a la Ley de Tejidos Humanos. Los cortes de tejido almacenados y los cultivos celulares primarios pueden luego transferirse para estudios inmunológicos a la Universidad de Nottingham para el trabajo experimental detallado anteriormente para cultivos celulares. Las condiciones de manejo, almacenamiento y transporte están definidas por el formulario HBA GEN45 y la transferencia estará regulada por un MTA.