Invasiivisten sairauksien kudosmallit (TIMID) (TIMID)

Tämä on prekliininen tutkimusprojekti, eikä potilaan interventiota ole suunniteltu. Hankkeessa hyödynnetään radikaalin leikkauksen aikana hylättyjä anonymisoituja ihmiskudosnäytteitä. Tähän projektiin sisältyvät pernaelinnäytteet ovat potilailta, joille tehdään elektiivinen leikkaus haimavaurion vuoksi Leicester General Hospitalin HPB-yksikössä. 24 pernan otoskoko on määritetty teholaskelmilla ja se on linjassa elektiivisellä haimaleikkauksella viime vuosien aikana poistettujen pernan määrän kanssa. Tästä tutkimuksesta ja näytteiden käytöstä ei tehty muutoksia leikkaustoimenpiteessä tai rekrytointituloksissa. Kaikilla pernanäytteillä tehdyllä kokeellisella työllä ei ole vaikutusta potilaaseen.

Kokeet sisältävät ex vivo -elinten perfuusion ja bakteerien tai virusten aiheuttaman infektion. Perfusoidun 24 pernan biopsiat käsitellään in vitro -kudosviipale- ja makrofagisoluviljelmää varten. Tuloksena saadut primaarisoluviljelmät ja kudosviipaleet varastoidaan pakastettuna tulevaa tutkimusta varten. Kaikissa in vitro -tutkimuksissa 24 elimellä ja niistä johdetuilla kudoksilla ja soluilla arvioidaan terapeuttisten interventioiden (vasta-aineet, reseptoriantagonistit, antibiootit ja muut molekyylit) vaikutusta pernasolujen kykyyn puhdistaa invasiivisia bakteereja tai viruksia. Kokeet suoritetaan aina, kun pernanäyte on saatavilla.

Yksityiskohtainen tekninen kuvaus kokeellisesta strategiasta, mukaan lukien strategia ihmiskudoksen varastointia ja hävittämistä varten, on seuraava:

1. Koko elimen ex vivo -perfuusio: Tämä työ tehdään elimen stabiloimiseksi, elimen infektoimiseksi ja sen jälkeen kudosviipaleiden ja solujen saamiseksi primääristä soluviljelyä varten. Olemme onnistuneesti perustaneet normotermisen ex vivo sian pernan perfuusiomallin. Tämän asiantuntemuksen avulla pystyimme määrittelemään sian pernan elinten keruun, kuljetuksen ja perfuusion parametrit jopa kuuden tunnin ajan ja mikä tärkeintä, kehitimme ja infektiomallin. Infektio osoitti bakteeripoistokapasiteetin säilymistä verestä ja hyvän suodatuskapasiteetin ja, mikä on olennaista tälle sovellukselle, että myös koko elinmallissa tietyt makrofagien alajoukot ovat sallivia bakteerien solunsisäiselle replikaatiolle. Tässä kokeellisessa sarjassa ehdotamme kokonaisten eksplantoitujen ihmisen pernan perfusointia. Toisin kuin sioilla, käytämme ihmisen elimen synteettistä väliainetta perfuusioon neutraloimaan tai minimoimaan hankittu immuniteetti. Histologia, konfokaalinen mikroskopia, FACS-analyysi sekä bakteerien ja virusten luettelointi ovat tärkeimmät menetelmät perfusoidun elimen analysoinnissa. Työn tämän osan tavoitteena on osoittaa, että bakteerit ja virukset pystyvät replikoitumaan koko elimen tasolla pernan kudoksen makrofageissa, kiinnittäen huomiota infektioita ehkäiseviin hoitoihin näiden varhaisten vaiheiden ehkäisyyn, jotka mahdollisesti estävät invasiivisia bakteeri- ja virussairauksia. Näytteet 24 kokonaisesta perfuusioelimestä ovat kudosviipaviljelmien ja primäärisoluviljelmien lähteet.
2. Primäärisoluviljelmät: Otamme 24 ihmisen pernasta näytteitä ihmisen kudosmakrofagien ja muiden immuunisolujen primaariviljelmää varten. Hiirten ja sikojen soluissa käytössä olevan metodologian avulla perustamme primaariviljelmiä ihmisen pernan immuunisoluista ja erityisesti makrofageista. Immuunisolut, mukaan lukien makrofagit ja neutrofiilit, puhdistetaan erilaisilla menetelmillä, mukaan lukien percoll-gradienttisentrifugointi, FACS ja magneettierotus, ja niitä viljellään jopa seitsemän päivää. Viljelmistä testataan useita parametreja, mukaan lukien sytokiinit, pintamarkkerit, kenen tahansa tuotanto ja geeniekspressio. Vuorovaikutuksen testaamiseksi bakteerien tai virusten kanssa viljellyt solut infektoidaan joukolla bakteeri- ja viruspatogeenejä. Muilla menetelmillä bakteeri- ja viruspatogeenien ja isäntäsolujen käyttäytymisen seurantaan käytetään konfokaalimikroskopiaa, FACS:ää ja RNAseq:ia. Sytokiinien, kemokiinien, lääkkeiden, antibioottien ja muiden yhdisteiden interventioita suoritetaan järjestelmän ohjattavuuden testaamiseksi. Tarkoituksena on tunnistaa interventiokohteet, soluviljelymallit on tarkoitettu tarjoamaan yksityiskohtaisia ​​kvantitatiivisia parametreja bakteerien tai virusten ja immuunisolujen, erityisesti kudosmakrofagien, vuorovaikutuksesta kontrolloidussa in vitro -viljelyjärjestelmässä. Tämän tarkoituksena on mahdollistaa keskitehoisten määritysten suunnittelu strategioiden testaamiseksi, jotka muuttavat invasiivisen taudin alkamista. Solut varastoidaan nestetypessä jatkotutkimusta varten.
3. Organotyyppiset viipaleviljelmät: 24 ihmisen pernasta johdetaan solujen lisäksi myös kudosnäytteitä organotyyppisiin viipaleviljelmiin. Aivoviipaleille hyvin laaditulla ja pernalle kuvatulla menetelmällä viljelemme organotyyppisiä ihmisen pernaviipaleviljelmiä. Nämä elinviipaleet ovat parempia kuin soluviljelmät, koska ne ylläpitävät elimen monisoluista spatiaalista mikroarkkitehtuuria, mikä on erityisen tärkeää kudosmakrofageja analysoitaessa. Aivoviipaviljelmien osalta infektoimme viipaleita bakteeri- tai viruspatogeeneillä ja seuraamme niiden kulkeutumista kudoksessa, solujen tartuntaa ja yksittäisten isäntäsolujen reaktiota. Kudosviipaviljelmän käytön pitäisi mahdollistaa immuunisolujen spesifisten alaryhmien, mukaan lukien makrofagit, kohdistuksen ja replikaation sallivan luonteen spesifinen tutkiminen. Tavoitteena on mahdollistaa infektoivien pesäkkeiden yksityiskohtainen kehittyminen pernassa, mukaan lukien infektoituneiden pernaviipaleiden aikakierroskonfokaalimikroskopia. Tämän mallin sytokiinien ja muiden isäntäperäisten molekyylien testaamisen odotetaan osoittavan interventioiden potentiaalin, jotka kohdistuvat immuunisolujen tiettyihin alaryhmiin, mukaan lukien makrofagit. Kudosviipaleet säilytetään nestetypessä jatkotutkimusta varten.

Näytteen siirto yksiköiden välillä: Suunniteltu 24 elimen perfuusio suoritetaan Leicester General Hospitalin HBP-yksikön laboratorioissa. Tietyissä tapauksissa elinperfuusio voidaan suorittaa Leicesterin yliopiston genetiikan ja genomibiologian laitoksella. Suhteellinen HBA-muoto on saatu (Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cell lines and primäärinen ihmisen solu- ja kudosviljelmä, päivämäärä 2.10.2017). Perfuusion aikana ja sen jälkeen otetaan kudosnäytteitä kudosviipaviljelmää ja primäärisoluviljelmää varten. Nämä kudosnäytteet siirretään Genetiikan ja genomibiologian laitokselle tai Infektio-, immuniteetti- ja tulehdusosastolle suunniteltua tutkimustyötä varten ja niitä säilytetään siellä ihmiskudoslain määräysten mukaisesti. Säilytetyt kudosviipaleet ja primääriset soluviljelmät voidaan sitten siirtää immunologisia tutkimuksia varten Nottinghamin yliopistoon kokeelliseen työhön, joka on kuvattu yksityiskohtaisesti yllä soluviljelmien osalta. Käsittelyn, varastoinnin ja kuljetuksen olosuhteet määritellään HBA-lomakkeessa GEN45 ja siirtoa säätelee MTA.