침습성 질병을 위한 조직 모델(TIMID) (TIMID)

이것은 전임상 연구 프로젝트이며 환자 개입이 계획되어 있지 않습니다. 이 프로젝트는 근치 수술 중에 버려진 익명의 인체 조직 샘플을 사용합니다. 이 프로젝트에 포함된 비장 장기 샘플은 Leicester 종합 병원의 HPB 유닛에서 췌장 병변에 대한 선택적 수술을 받는 환자의 것입니다. 24개의 비장의 샘플 크기는 전력 계산에 의해 결정되었으며 지난 몇 년 동안 선택적 췌장 수술로 실제로 제거된 비장의 수와 일치합니다. 이 연구 및 샘플 사용에서 수술 절차 또는 모집 결과에 변화가 없습니다. 비장 샘플에 대해 수행된 모든 실험 작업은 환자에게 영향을 미치지 않습니다.

실험에는 생체 외 장기 관류 및 박테리아 또는 바이러스 감염이 포함됩니다. 관류된 24개의 비장의 생검은 시험관내 조직 절편 및 대식세포 세포 배양을 위해 처리된다. 생성된 1차 세포 배양 및 조직 슬라이스는 향후 연구를 위해 냉동 보관됩니다. 24개의 기관과 그로부터 파생된 조직 및 세포에 대한 모든 시험관 내 연구는 침습성 박테리아 또는 바이러스를 제거하는 비장 세포의 능력에 대한 치료 개입(항체, 수용체 길항제, 항생제 및 기타 분자)의 효과를 평가할 것입니다. 실험은 비장 샘플을 사용할 수 있을 때마다 수행됩니다.

인체 조직의 보관 및 폐기 전략을 포함한 실험 전략에 대한 자세한 기술적 설명은 다음과 같습니다.

1. 전체 장기 체외 관류: 이 작업은 장기를 안정화하고 장기를 감염시킨 다음 일차 세포 배양을 위해 조직 절편과 세포에서 추출하기 위해 수행됩니다. 우리는 성공적으로 정상 체온 전 생체 돼지 비장 관류 모델을 설정했습니다. 이 전문 지식을 통해 최대 6시간 동안 돼지 비장의 장기 수집, 운송 및 관류에 대한 매개 변수를 정의하고 중요하게는 감염 모델을 개발할 수 있었습니다. 감염은 혈액에서 박테리아를 제거하는 능력의 보존과 우수한 여과 능력을 보여주었고, 이 적용에 필수적이며, 전체 기관 모델에서도 대식세포의 특정 하위 집합이 박테리아 세포내 복제를 허용합니다. 이 실험 시리즈에서 우리는 전체 외식 인간 비장을 관류할 것을 제안합니다. 돼지와 달리 후천면역을 중화 또는 최소화하기 위해 인체장기합성배지의 관류용으로 사용합니다. 조직학, 공초점 현미경, FACS 분석 및 세균 및 바이러스 계수는 관류 기관을 분석하는 주요 방법론이 될 것입니다. 작업의 이 부분의 목적은 전체 장기 수준에서 박테리아와 바이러스가 비장 조직 대식세포에서 복제할 수 있음을 입증하여 잠재적으로 침습성 박테리아 및 바이러스성 질병을 예방하는 이러한 초기 단계의 예방에 대한 항감염 치료의 관심을 정확히 지적하는 것입니다. 24개 전체 관류 기관의 샘플은 조직 슬라이스 배양 및 1차 세포 배양의 소스가 됩니다.
2. 1차 세포 배양: 24개의 인간 비장에서 인간 조직 대식세포 및 기타 면역 세포의 1차 배양을 위한 샘플을 추출합니다. 쥐와 돼지의 세포에 사용되는 방법론을 사용하여 인간 비장 면역 세포, 특히 대식세포의 일차 배양을 설정합니다. 대식세포 및 호중구를 포함한 면역 세포는 퍼콜 구배 원심분리, FACS 및 자기 분리를 포함한 다양한 방법으로 정제되고 최대 7일 동안 배양됩니다. 배양은 사이토카인, 표면 마커, 생산 및 유전자 발현을 포함한 여러 매개변수에 대해 테스트됩니다. 박테리아 또는 바이러스와의 상호 작용을 테스트하기 위해 배양된 세포를 박테리아 및 바이러스 병원체 패널로 감염시킵니다. 다른 방법론에 따라 공초점 현미경, FACS 및 RNAseq는 박테리아 및 바이러스 병원체와 숙주 세포의 행동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 사이토카인, 케모카인, 약물, 항생제 및 기타 화합물을 사용한 개입이 시스템의 다루기 쉬운 테스트를 위해 수행됩니다. 개입 대상을 식별하기 위해 세포 배양 모델은 제어된 체외 배양 시스템에서 박테리아 또는 바이러스와 특정 조직 대식세포의 면역 세포의 상호 작용에 대한 자세한 정량화 가능한 매개변수를 제공하기 위한 것입니다. 이것은 침입성 질병의 시작을 수정하는 전략을 테스트하기 위해 중간 처리량 분석의 설계를 허용하기 위한 것입니다. 세포는 추가 연구를 위해 액체 질소에 보관됩니다.
3. Organotypic 슬라이스 배양: 24개의 인간 비장에서 우리는 세포 외에도 Organotypic 슬라이스 배양을 위한 조직 샘플을 파생합니다. 뇌 슬라이스에 대해 잘 설정되고 비장에 대해 설명된 방법론을 통해 우리는 기관형 인간 비장 슬라이스 문화를 배양할 것입니다. 이러한 장기 슬라이스는 조직 대식세포를 분석할 때 특히 중요한 장기의 다세포 공간 미세아키텍처를 유지하기 때문에 세포 배양보다 우수합니다. 뇌 슬라이스 배양의 경우, 우리는 박테리아 또는 바이러스 병원균으로 슬라이스를 감염시키고 조직 내 이동, 세포 감염 및 단일 숙주 세포의 반응을 모니터링합니다. 조직 슬라이스 배양을 사용하면 대식세포를 포함한 면역 세포의 특정 하위 집합의 표적화 및 복제 허용 특성을 구체적으로 연구할 수 있어야 합니다. 목적의 목표는 감염된 비장 조각의 시간 랩 공초점 현미경을 포함하여 비장에서 감염성 초점의 상세한 개발을 허용하는 것입니다. 이 모델 사이토카인 및 기타 숙주 유래 분자에서의 테스트는 대식세포를 포함한 면역 세포의 특정 하위 집합을 표적으로 하는 개입의 가능성을 보여줄 것으로 예상됩니다. 조직 조각은 추가 연구를 위해 액체 질소에 저장됩니다.

단위 간 샘플 전송: 계획된 24개의 장기 관류는 Leicester 종합 병원의 HBP 단위 실험실에서 수행됩니다. 일부 사례에서 장기 관류는 University of Leicester의 유전학 및 게놈 생물학과에서 수행될 수 있습니다. 관련 HBA 형태를 얻었습니다(Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cell lines and primary human cell and tissue culture, date 02/10/2017). 관류 중 및 후에 조직 절편 배양 및 1차 세포 배양을 위한 조직 샘플을 채취합니다. 이러한 조직 샘플은 예정된 연구 작업을 위해 유전 및 게놈 생물학과 또는 감염 및 면역 및 염증과로 이송되어 인체 조직법에 관한 규정에 따라 보관됩니다. 저장된 조직 절편과 1차 세포 배양은 세포 배양에 대해 위에서 설명한 실험 작업을 위해 면역학 연구를 위해 University of Nottingham으로 옮길 수 있습니다. 취급, 보관 및 운송 조건은 HBA 양식 GEN45에 정의되어 있으며 운송은 MTA에서 규제합니다.