Tkáňové modely pro invazivní onemocnění (TIMID) (TIMID)

Jedná se o předklinický výzkumný projekt a není plánován žádný zásah pacienta. Projekt využívá anonymizované vzorky lidské tkáně vyřazené během radikální operace. Vzorky orgánů sleziny zahrnuté v tomto projektu budou od pacientů podstupujících elektivní operaci léze ve slinivce na HPB jednotce Leicester General Hospital. Velikost vzorku 24 slezin byla určena výpočtem výkonu a je v souladu s počtem slezin skutečně odstraněných elektivní operací slinivky břišní v posledních letech. Žádná změna v chirurgickém postupu nebo náboru výsledků z této studie a použití vzorků. Veškerá experimentální práce provedená na vzorcích sleziny nebude mít na pacienta žádný vliv.

Experimenty zahrnují ex vivo perfuzi orgánů a infekci bakteriemi nebo viry. Biopsie perfundovaných 24 slezin se zpracují pro in vitro tkáňové řezy a makrofágovou buněčnou kulturu. Výsledné primární buněčné kultury a tkáňové řezy budou uloženy zmrazené pro budoucí výzkum. Všechny studie in vitro na 24 orgánech a tkáních a buňkách z nich odvozených vyhodnotí účinek terapeutických intervencí (protilátky, antagonisté receptorů, antibiotika a další molekuly) na schopnost buněk sleziny vyčistit invazivní bakterie nebo viry. Experimenty budou provedeny pokaždé, když bude k dispozici vzorek sleziny.

Podrobný technický popis experimentální strategie včetně strategie skladování a likvidace lidské tkáně bude následující:

1. Perfuze celého orgánu ex vivo: Tato práce se provádí za účelem stabilizace orgánu, infikování orgánu a následného získání tkáňových řezů a buněk pro primární buněčnou kulturu. Úspěšně jsme vytvořili normotermický ex vivo model perfuze prasečí sleziny. Tato odbornost nám umožnila definovat parametry odběru orgánů, transportu a perfuze prasečí sleziny po dobu až šesti hodin a především vyvinout a infekční model. Infekce prokázala zachování schopnosti odstraňovat bakterie z krve a dobrou filtrační kapacitu a podstatné pro tuto aplikaci, že také v celém orgánovém modelu jsou specifické podskupiny makrofágů permisivní pro bakteriální intracelulární replikaci. V této experimentální sérii navrhujeme perfuzi celých explantovaných lidských slezin. Na rozdíl od prasat použijeme k perfuzi syntetické médium lidského orgánu za účelem neutralizace nebo minimalizace získané imunity. Histologie, konfokální mikroskopie, FACS analýza a bakteriální a virové počítání budou hlavními metodikami analýzy perfundovaného orgánu. Cílem této části práce je demonstrovat, že na celoorgánové úrovni jsou bakterie a viry schopny replikovat se v makrofázích slezinné tkáně, přičemž pozornost antiinfekční léčby je zaměřena na prevenci těchto časných kroků potenciálně zabraňujících invazivním bakteriálním a virovým onemocněním. Vzorky z 24 celých perfundovaných orgánů budou zdrojem kultur tkáňových řezů a primárních buněčných kultur.
2. Primární buněčné kultury: Z 24 lidských slezin odvodíme vzorky pro primární kultivaci lidských tkáňových makrofágů a dalších imunitních buněk. Pomocí metodiky používané pro buňky z myší a prasat vytvoříme primární kultury imunitních buněk lidské sleziny a zejména makrofágů. Imunitní buňky včetně makrofágů a neutrofilů budou purifikovány různými metodologiemi včetně centrifugace v gradientu percoll, FACS a magnetické separace a kultivovány po dobu až sedmi dnů. Kultury budou testovány na různé parametry včetně cytokinů, povrchových markerů, produkce kohokoli a genové exprese. Pro testování interakce s bakteriemi nebo viry budou kultivované buňky infikovány panelem bakteriálních a virových patogenů. Na základě jiné metodiky bude využita konfokální mikroskopie, FACS a RNAseq k monitorování chování bakteriálních a virových patogenů a hostitelských buněk. Budou provedeny intervence s cytokiny, chemokiny, léky, antibiotiky a dalšími sloučeninami, aby se otestovala ovladatelnost systému. S cílem identifikovat cíle pro intervenci jsou modely buněčných kultur zamýšleny tak, aby poskytovaly podrobné kvantifikovatelné parametry interakce bakterií nebo virů a imunitních buněk v konkrétních tkáňových makrofázích v kontrolovaném kultivačním systému in vitro. To má umožnit návrh středně výkonných testů pro testování strategií modifikujících zahájení invazivního onemocnění. Pro další výzkum budou buňky uloženy v kapalném dusíku.
3. Organotypické řezové kultury: Z 24 lidských slezin získáme kromě buněk také tkáňové vzorky pro organotypické řezové kultury. S metodikou dobře nastavenou pro řezy mozku a popsanou pro slezinu budeme kultivovat organotypické kultury řezů lidské sleziny. Tyto plátky orgánů jsou lepší než buněčné kultury, protože zachovávají mnohobuněčnou prostorovou mikroarchitekturu orgánu, což je zvláště důležité při analýze tkáňových makrofágů. Pokud jde o kultury mozkových řezů, budeme řezy infikovat bakteriálními nebo virovými patogeny a sledovat jejich migraci v tkáni, infekci buněk a reakci jednotlivých hostitelských buněk. Použití kultury tkáňových řezů by mělo umožnit specificky studovat zacílení a replikaci-permisivní povahu specifických podskupin imunitních buněk včetně makrofágů. Cílem cíle je umožnit detailní vývoj infekčních ložisek ve slezině včetně časosběrné konfokální mikroskopie infikovaných řezů sleziny. Očekává se, že testování v tomto modelu cytokinů a dalších molekul odvozených od hostitele ukáže potenciál intervencí zaměřených na specifické podskupiny imunitních buněk včetně makrofágů. Tkáňové řezy budou uloženy v kapalném dusíku pro další výzkum.

Přenos vzorků mezi jednotkami: Plánovaná perfuze 24 orgánů bude provedena v laboratořích jednotky HBP Všeobecné nemocnice v Leicesteru. Ve vybraných případech může být perfuze orgánů provedena na katedře genetiky a biologie genomu Univerzity v Leicesteru. Byla získána relativní forma HBA (Hazardous Biological Agents z buněčných linií GEN/45 a primární lidské buněčné a tkáňové kultury, datum 2. 10. 2017). Během a po perfuzi budou odebrány vzorky tkáně pro kultivaci tkáňových řezů a primární buněčnou kulturu. Tyto vzorky tkání budou předány k plánovaným výzkumným pracím na Oddělení genetiky a biologie genomu nebo Oddělení infekcí a imunity a zánětů a budou zde uloženy v souladu s předpisy souvisejícími se zákonem o lidských tkáních. Uložené tkáňové řezy a primární buněčné kultury mohou být poté přeneseny pro imunologické studie na University of Nottingham pro experimentální práci podrobně popsanou výše pro buněčné kultury. Podmínky pro manipulaci, skladování a přepravu definuje HBA formulář GEN45 a převod bude regulován MTA.