Vævsmodeller for invasiv sygdom (TIMID) (TIMID)

Dette er et præklinisk forskningsprojekt, og der er ikke planlagt patientintervention. Projektet gør brug af anonymiserede humane vævsprøver kasseret under radikal kirurgi. Miltorganprøverne inkluderet i dette projekt vil være fra patienter, der gennemgår elektiv kirurgi for en læsion i bugspytkirtlen i HPB-enheden på Leicester General Hospital. Prøvestørrelsen på 24 milte er blevet bestemt ved kraftberegninger og er på linje med antallet af milte, der faktisk er blevet fjernet ved elektiv bugspytkirtelkirurgi over de seneste år. Ingen ændring i den kirurgiske procedure eller rekrutteringsresultater fra denne undersøgelse og brugen af ​​prøverne. Alt det eksperimentelle arbejde, der udføres på miltprøverne, vil ikke have nogen effekt på patienten.

Eksperimenter omfatter ex vivo organperfusion og infektion med bakterier eller vira. Biopsier af de perfunderede 24 milte behandles til in vitro vævsskive og makrofagcellekultur. De resulterende primære cellekulturer og vævsskiver vil blive opbevaret frosset til fremtidig forskning. Alle in vitro undersøgelser af de 24 organer og væv og celler afledt af dem vil evaluere effekten af ​​terapeutiske indgreb (antistoffer, receptorantagonister, antibiotika og andre molekyler) på miltcellernes evne til at rense invasive bakterier eller vira. Forsøgene vil blive udført hver gang en miltprøve vil være tilgængelig.

Den detaljerede tekniske beskrivelse af den eksperimentelle strategi, herunder strategien for opbevaring og kassering af det humane væv, vil være som følger:

1. Hele organ ex vivo perfusion: Dette arbejde udføres for at stabilisere organet, inficere organet og derefter udlede vævsskiver og celler fra det til primær cellekultur. Vi har med succes opsat en normo-termisk ex vivo porcin miltperfusionsmodel. Denne ekspertise gjorde det muligt for os at definere parametrene for organindsamling, transport og perfusion af svinemilt i op til seks timer og vigtigst af alt udvikle og infektionsmodel. Infektion viste bevarelse af kapaciteten til at fjerne bakterier fra blod og god filtreringskapacitet og, væsentligt for denne anvendelse, at også i hele organmodellen er specifikke undergrupper af makrofager tolerante for bakteriel intracellulær replikation. I denne eksperimentelle serie foreslår vi at perfundere hele eksplanterede menneskelige milte. I modsætning til grise, vil vi bruge til perfusion af det menneskelige organ syntetisk medium for at neutralisere eller minimere erhvervet immunitet. Histologi, konfokal mikroskopi, FACS-analyse og bakteriel og viral optælling vil være de vigtigste metoder til at analysere det perfunderede organ. Formålet med denne del af arbejdet er at demonstrere, at bakterier og vira på hele organniveau er i stand til at replikere i miltvævsmakrofager, hvorved anti-infektionsbehandlinger er opmærksomme på forebyggelsen af ​​disse tidlige trin, der potentielt kan forhindre invasiv bakteriel og viral sygdom. Prøver fra de 24 hele perfunderede organer vil være kilden til vævsskivekulturer og primære cellekulturer.
2. Primære cellekulturer: Fra de 24 humane milte vil vi udlede prøver til primær dyrkning af humane vævsmakrofager og andre immunceller. Ved at bruge den metode, der er i brug for celler fra mus og grise, vil vi opsætte primære kulturer af humane miltimmunceller og især makrofager. Immunceller inklusive makrofager og neutrofiler vil blive oprenset ved forskellige metoder, herunder ved percoll-gradientcentrifugering, FACS og magnetisk separation og dyrket i op til syv dage. Kulturer vil blive testet for flere parametre, herunder cytokiner, overflademarkører, enhver produktion og genekspression. For at teste interaktion med bakterier eller vira vil de dyrkede celler blive inficeret med et panel af bakterielle og virale patogener. Ved anden metodologi vil konfokal mikroskopi, FACS og RNAseq blive brugt til at overvåge adfærd af bakterielle og virale patogener og værtsceller. Interventioner med cytokiner, kemokiner, lægemidler, antibiotika og andre forbindelser vil blive udført for at teste systemets medførbarhed. Med det formål for øje at identificere mål for intervention er cellekulturmodellerne beregnet til at give detaljerede kvantificerbare parametre for interaktionen mellem bakterier eller vira og immunceller i særlige vævsmakrofager i et kontrolleret in vitro kultursystem. Dette er beregnet til at muliggøre design af medium-throughput assays til at teste strategier, der modificerer initiering af invasiv sygdom. Celler vil blive opbevaret i flydende nitrogen til yderligere forskning.
3. Organotypiske skivekulturer: Fra de 24 menneskelige milte vil vi ud over celler også udlede vævsprøver til organotypiske skivekulturer. Med metoden godt sat op for hjerneskiver og beskrevet for milt, vil vi dyrke organotypiske humane miltskivekulturer. Disse organskiver er overlegne i forhold til cellekulturer, da de opretholder organets multicellulære rumlige mikroarkitektur, hvilket er særligt vigtigt, når man analyserer vævsmakrofager. Hvad angår hjerneskivekulturer, vil vi inficere skiverne med bakterielle eller virale patogener og overvåge deres migration i vævet, infektionen af ​​celler og reaktionen af ​​de enkelte værtsceller. Brugen af ​​vævsskivekultur bør gøre det muligt specifikt at studere den målretnings- og replikations-permissive karakter af specifikke undergrupper af immunceller, herunder makrofager. Et mål med målet er at give mulighed for detaljeret udvikling af infektiøse foci i milten, herunder tidsomgange konfokal mikroskopi af inficerede miltskiver. Testning i denne model cytokiner og andre værtsafledte molekyler forventes at vise potentialet af interventioner rettet mod specifikke undergrupper af immunceller, herunder makrofager. Vævsskiver vil blive opbevaret i flydende nitrogen til yderligere forskning.

Prøveoverførsel mellem enheder: De 24 planlagte organperfusion vil blive udført på laboratorierne på HBP-enheden på Leicester General Hospital. I udvalgte tilfælde kan organperfusion udføres ved Institut for Genetik og Genombiologi ved University of Leicester. Den relative HBA-form er opnået (Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cellelinjer og primær human celle- og vævskultur, dato 02/10/2017). Under og efter perfusion vil der blive taget vævsprøver til vævsskivekultur og primær cellekultur. Disse vævsprøver vil blive overført til Institut for Genetik og Genombiologi eller Afd. for Infektion og Immunitet og Inflammation til det planlagte forskningsarbejde og vil blive opbevaret der i overensstemmelse med reglerne i loven om humant væv. Lagrede vævsskiver og primære cellekulturer kan derefter overføres til immunologiske undersøgelser til University of Nottingham for eksperimentelt arbejde beskrevet ovenfor for cellekulturer. Betingelser for håndtering, opbevaring og transport er defineret af HBA-formularen GEN45 og overførsel vil blive reguleret af en MTA.