Gewebemodelle für invasive Erkrankungen (TIMID) (TIMID)

Dies ist ein präklinisches Forschungsprojekt und es ist keine Patientenintervention geplant. Das Projekt nutzt anonymisierte menschliche Gewebeproben, die bei Radikaloperationen verworfen wurden. Die in diesem Projekt enthaltenen Milzorganproben stammen von Patienten, die sich in der HPB-Abteilung des Leicester General Hospital einer elektiven Operation wegen einer Läsion in der Bauchspeicheldrüse unterziehen. Die Stichprobengröße von 24 Milzen wurde durch Power-Berechnungen bestimmt und entspricht der Anzahl der Milzen, die in den letzten Jahren tatsächlich durch elektive Pankreasoperationen entfernt wurden. Keine Änderung des chirurgischen Verfahrens oder der Rekrutierungsergebnisse aus dieser Studie und der Verwendung der Proben. Alle experimentellen Arbeiten, die an den Milzproben durchgeführt werden, haben keine Auswirkungen auf den Patienten.

Zu den Experimenten gehören Ex-vivo-Organperfusion und Infektion mit Bakterien oder Viren. Biopsien der perfundierten 24 Milzen werden für in vitro-Gewebeschnitte und Makrophagen-Zellkulturen verarbeitet. Die resultierenden primären Zellkulturen und Gewebeschnitte werden für die zukünftige Forschung eingefroren gelagert. Alle In-vitro-Studien an den 24 Organen und den daraus gewonnenen Geweben und Zellen werden die Wirkung therapeutischer Interventionen (Antikörper, Rezeptorantagonisten, Antibiotika und andere Moleküle) auf die Fähigkeit von Milzzellen, invasive Bakterien oder Viren zu beseitigen, bewerten. Die Experimente werden jedes Mal durchgeführt, wenn eine Milzprobe verfügbar ist.

Die detaillierte technische Beschreibung der experimentellen Strategie, einschließlich der Strategie zur Lagerung und Entsorgung des menschlichen Gewebes, wird wie folgt lauten:

1. Ex-vivo-Perfusion des gesamten Organs: Diese Arbeit wird durchgeführt, um das Organ zu stabilisieren, das Organ zu infizieren und dann daraus Gewebeschnitte und Zellen für die primäre Zellkultur zu gewinnen. Wir haben erfolgreich ein normo-thermisches Ex-vivo-Schweinemilz-Perfusionsmodell aufgebaut. Dieses Fachwissen ermöglichte es uns, die Parameter für die Organentnahme, den Transport und die Perfusion von Schweinemilzen für bis zu sechs Stunden zu definieren und vor allem ein Infektionsmodell zu entwickeln. Die Infektion zeigte eine Erhaltung der Fähigkeit, Bakterien aus dem Blut zu entfernen, und eine gute Filterkapazität und, was für diese Anwendung wesentlich ist, dass auch in dem Gesamtorganmodell spezifische Untergruppen von Makrophagen eine bakterielle intrazelluläre Replikation zulassen. In dieser experimentellen Serie schlagen wir vor, ganze explantierte menschliche Milzen zu perfundieren. Im Gegensatz zu Schweinen werden wir zur Perfusion des menschlichen Organs synthetisches Medium verwenden, um erworbene Immunität zu neutralisieren oder zu minimieren. Histologie, konfokale Mikroskopie, FACS-Analyse und bakterielle und virale Zählung werden die wichtigsten Methoden zur Analyse des perfundierten Organs sein. Das Ziel dieses Teils der Arbeit ist es, zu zeigen, dass Bakterien und Viren auf der Ebene des gesamten Organs in Milzgewebe-Makrophagen replizieren können, wodurch die Aufmerksamkeit von antiinfektiösen Behandlungen auf die Verhinderung dieser frühen Schritte gerichtet wird, die möglicherweise invasive bakterielle und virale Erkrankungen verhindern. Proben aus den 24 vollständig perfundierten Organen werden die Quelle für Gewebeschnittkulturen und primäre Zellkulturen sein.
2. Primäre Zellkulturen: Aus den 24 menschlichen Milzen werden wir Proben für die Primärkultur von menschlichen Gewebemakrophagen und anderen Immunzellen gewinnen. Unter Verwendung der für Zellen von Mäusen und Schweinen verwendeten Methodik werden wir Primärkulturen menschlicher Milz-Immunzellen und insbesondere Makrophagen anlegen. Immunzellen, einschließlich Makrophagen und Neutrophile, werden mit verschiedenen Methoden gereinigt, darunter Percoll-Gradientenzentrifugation, FACS und magnetische Separation, und bis zu sieben Tage lang kultiviert. Die Kulturen werden auf mehrere Parameter getestet, darunter Zytokine, Oberflächenmarker, Anybody-Produktion und Genexpression. Um die Wechselwirkung mit Bakterien oder Viren zu testen, werden die kultivierten Zellen mit einer Reihe von bakteriellen und viralen Pathogenen infiziert. Als weitere Methoden werden konfokale Mikroskopie, FACS und RNAseq verwendet, um das Verhalten von bakteriellen und viralen Pathogenen und Wirtszellen zu überwachen. Eingriffe mit Zytokinen, Chemokinen, Medikamenten, Antibiotika und anderen Verbindungen werden durchgeführt, um die Handhabbarkeit des Systems zu testen. Mit dem Ziel, Angriffspunkte zu identifizieren, sollen die Zellkulturmodelle detailliert quantifizierbare Parameter der Interaktion von Bakterien oder Viren und Immunzellen, insbesondere Gewebemakrophagen, in einem kontrollierten in-vitro-Kultursystem liefern. Dies soll das Design von Assays mit mittlerem Durchsatz ermöglichen, um Strategien zu testen, die den Beginn einer invasiven Erkrankung modifizieren. Die Zellen werden für die weitere Forschung in flüssigem Stickstoff gelagert.
3. Organotypische Schnittkulturen: Aus den 24 menschlichen Milzen werden wir neben Zellen auch Gewebeproben für organotypische Schnittkulturen gewinnen. Mit der für Gehirnscheiben gut eingerichteten und für die Milz beschriebenen Methodik werden wir organotypische menschliche Milzscheibenkulturen kultivieren. Diese Organschnitte sind Zellkulturen überlegen, da sie die vielzellige räumliche Mikroarchitektur des Organs erhalten, was besonders bei der Analyse von Gewebemakrophagen wichtig ist. Bei Hirnschnittkulturen werden wir die Schnitte mit bakteriellen oder viralen Krankheitserregern infizieren und deren Wanderung innerhalb des Gewebes, die Infektion von Zellen und die Reaktion der einzelnen Wirtszellen überwachen. Die Verwendung von Gewebeschnittkulturen sollte es ermöglichen, die zielgerichtete und replikationszulässige Natur spezifischer Untergruppen von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, spezifisch zu untersuchen. Ein Ziel des Ziels ist es, eine detaillierte Entwicklung von infektiösen Herden in der Milz zu ermöglichen, einschließlich konfokaler Zeitraffermikroskopie von infizierten Milzschnitten. Das Testen von Zytokinen und anderen vom Wirt stammenden Molekülen in diesem Modell soll das Potenzial von Interventionen zeigen, die auf bestimmte Untergruppen von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, abzielen. Gewebeschnitte werden für die weitere Forschung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Probentransfer zwischen den Einheiten: Die 24 geplanten Organperfusionen werden in den Labors der HBP-Einheit des Leicester General Hospital durchgeführt. In ausgewählten Fällen kann die Organperfusion am Department of Genetics and Genome Biology der University of Leicester durchgeführt werden. Das entsprechende HBA-Formular wurde erhalten (Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cell lines and primary human cell and tissue culture, date 10.02.2017). Während und nach der Perfusion werden Gewebeproben für die Gewebeschnittkultur und die primäre Zellkultur entnommen. Diese Gewebeproben werden für die geplanten Forschungsarbeiten an die Abteilung für Genetik und Genombiologie bzw. Abteilung für Infektions- und Immunität und Entzündungsforschung übergeben und dort gemäß den Vorschriften des Human Tissue Act gelagert. Gelagerte Gewebeschnitte und primäre Zellkulturen können dann für immunologische Studien an die University of Nottingham für experimentelle Arbeiten, die oben für Zellkulturen beschrieben sind, übertragen werden. Die Handhabungs-, Lagerungs- und Transportbedingungen werden durch das HBA-Formular GEN45 definiert und der Transfer wird durch ein MTA geregelt.