Modele tkankowe dla choroby inwazyjnej (TIMID) (TIMID)

Jest to przedkliniczny projekt badawczy i nie planuje się interwencji pacjenta. W projekcie wykorzystano anonimowe próbki tkanek ludzkich wyrzucone podczas radykalnej operacji. Próbki narządów śledziony uwzględnione w tym projekcie będą pochodzić od pacjentów poddawanych planowej operacji zmiany w trzustce na oddziale HPB Szpitala Ogólnego w Leicester. Wielkość próbki 24 śledziony została określona za pomocą obliczeń mocy i jest zgodna z liczbą śledzion faktycznie usuniętych w ramach planowej operacji trzustki w ciągu ostatnich lat. Żadne zmiany w procedurze chirurgicznej lub rekrutacji nie wynikają z tego badania i wykorzystania próbek. Wszystkie prace eksperymentalne przeprowadzone na próbkach śledziony nie będą miały wpływu na pacjenta.

Eksperymenty obejmują perfuzję narządów ex vivo i infekcję bakteriami lub wirusami. Biopsje perfundowanych 24 śledzion są przetwarzane do skrawków tkanki in vitro i hodowli komórkowej makrofagów. Powstałe pierwotne hodowle komórkowe i skrawki tkanek będą przechowywane w stanie zamrożonym do przyszłych badań. Wszystkie badania in vitro na 24 narządach oraz pochodzących z nich tkankach i komórkach będą oceniać wpływ interwencji terapeutycznych (przeciwciała, antagoniści receptorów, antybiotyki i inne molekuły) na zdolność komórek śledziony do usuwania inwazyjnych bakterii lub wirusów. Eksperymenty będą przeprowadzane za każdym razem, gdy dostępna będzie próbka śledziony.

Szczegółowy opis techniczny strategii eksperymentalnej, w tym strategii przechowywania i usuwania tkanki ludzkiej, będzie następujący:

1. Perfuzja całego narządu ex vivo: ta praca ma na celu stabilizację narządu, zakażenie narządu, a następnie uzyskanie z niego skrawków tkanki i komórek do pierwotnej hodowli komórkowej. Udało nam się stworzyć normotermiczny model perfuzji śledziony świni ex vivo. Ta ekspertyza pozwoliła nam określić parametry pobierania narządów, transportu i perfuzji śledziony świń przez okres do sześciu godzin oraz, co ważne, opracować model zakażenia. Zakażenie wykazało zachowanie zdolności do usuwania bakterii z krwi i dobrą zdolność filtrowania oraz, co istotne dla tego zastosowania, że ​​również w modelu całego narządu określone podzbiory makrofagów pozwalają na replikację wewnątrzkomórkową bakterii. W tej serii eksperymentów proponujemy perfuzję całych usuniętych ludzkich śledzion. W przeciwieństwie do świń, do perfuzji ludzkich narządów użyjemy syntetycznego podłoża w celu zneutralizowania lub zminimalizowania nabytej odporności. Histologia, mikroskopia konfokalna, analiza FACS oraz liczba bakterii i wirusów będą głównymi metodologiami analizy perfundowanego narządu. Celem tej części pracy jest wykazanie, że na poziomie całego narządu bakterie i wirusy są zdolne do replikacji w makrofagach tkanki śledziony, zwracając uwagę leczenia przeciwinfekcyjnego na zapobieganie tym wczesnym etapom, potencjalnie zapobiegając inwazyjnym chorobom bakteryjnym i wirusowym. Próbki z 24 całych perfundowanych narządów będą źródłem kultur skrawków tkankowych i pierwotnych hodowli komórkowych.
2. Pierwotne hodowle komórkowe: Z 24 ludzkich śledzion pobierzemy próbki do pierwotnej hodowli ludzkich makrofagów tkankowych i innych komórek odpornościowych. Korzystając z metodologii stosowanej w przypadku komórek myszy i świń, stworzymy pierwotne hodowle ludzkich komórek odpornościowych śledziony, aw szczególności makrofagów. Komórki odpornościowe, w tym makrofagi i neutrofile, zostaną oczyszczone różnymi metodami, w tym przez wirowanie w gradiencie percoll, FACS i separację magnetyczną, i będą hodowane przez maksymalnie siedem dni. Hodowle będą testowane pod kątem wielu parametrów, w tym cytokin, markerów powierzchniowych, produkcji kogokolwiek i ekspresji genów. Aby przetestować interakcję z bakteriami lub wirusami, hodowane komórki zostaną zainfekowane panelem patogenów bakteryjnych i wirusowych. W oparciu o inną metodologię, mikroskopia konfokalna, FACS i RNAseq zostaną wykorzystane do monitorowania zachowania patogenów bakteryjnych i wirusowych oraz komórek gospodarza. Zostaną przeprowadzone interwencje z cytokinami, chemokinami, lekami, antybiotykami i innymi związkami, aby przetestować podatność systemu. Mając na uwadze identyfikację celów interwencji, modele hodowli komórkowych mają na celu dostarczenie szczegółowych, wymiernych parametrów interakcji bakterii lub wirusów i komórek odpornościowych, w szczególności makrofagów tkankowych, w kontrolowanym systemie hodowli in vitro. Ma to umożliwić zaprojektowanie testów o średniej przepustowości do testowania strategii modyfikujących inicjację choroby inwazyjnej. Komórki będą przechowywane w ciekłym azocie do dalszych badań.
3. Organotypowe hodowle skrawkowe: Z 24 ludzkich śledzion pobierzemy, oprócz komórek, również próbki tkanek do hodowli organotypowych. Mając metodologię dobrze opracowaną dla skrawków mózgu i opisaną dla śledziony, będziemy hodować organotypowe hodowle skrawków ludzkiej śledziony. Te wycinki narządów są lepsze od kultur komórkowych, ponieważ utrzymują wielokomórkową przestrzenną mikroarchitekturę narządu, co jest szczególnie ważne przy analizie makrofagów tkankowych. Jeśli chodzi o hodowle wycinków mózgu, będziemy je infekować bakteryjnymi lub wirusowymi patogenami i monitorować ich migrację w tkance, infekcję komórek i reakcję pojedynczych komórek gospodarza. Zastosowanie hodowli wycinków tkankowych powinno pozwolić na szczegółowe zbadanie ukierunkowanego i permisywnego charakteru replikacji określonych podzbiorów komórek odpornościowych, w tym makrofagów. Celem tego celu jest umożliwienie szczegółowego rozwoju ognisk zakaźnych w śledzionie, w tym mikroskopii konfokalnej poklatkowej zakażonych skrawków śledziony. Oczekuje się, że testowanie w tym modelu cytokin i innych cząsteczek pochodzących od gospodarza wykaże potencjał interwencji ukierunkowanych na określone podzbiory komórek odpornościowych, w tym makrofagi. Wycinki tkanek będą przechowywane w ciekłym azocie do dalszych badań.

Transfer próbek między oddziałami: 24 planowane perfuzje narządów zostaną przeprowadzone w laboratoriach oddziału HBP Szpitala Ogólnego w Leicester. W wybranych przypadkach perfuzję narządów można wykonać w Zakładzie Genetyki i Biologii Genomu Uniwersytetu w Leicester. Uzyskano względny formularz HBA (Niebezpieczne czynniki biologiczne z linii komórkowych GEN/45 i pierwotnej hodowli komórek i tkanek ludzkich, data 02.10.2017). Podczas i po perfuzji zostaną pobrane próbki tkanek do hodowli skrawków tkanki i pierwotnej hodowli komórkowej. Próbki tkanek zostaną przekazane do Zakładu Genetyki i Biologii Genomu lub Zakładu Zakażeń i Odporności i Zapaleń do planowych prac badawczych i będą tam przechowywane zgodnie z przepisami dotyczącymi ustawy o tkankach ludzkich. Przechowywane skrawki tkanek i pierwotne hodowle komórkowe można następnie przenieść do badań immunologicznych na University of Nottingham w celu przeprowadzenia prac eksperymentalnych opisanych powyżej w odniesieniu do kultur komórkowych. Warunki obsługi, przechowywania i transportu są określone w formularzu HBA GEN45, a transfer będzie regulowany przez MTA.