Vevsmodeller for invasiv sykdom (TIMID) (TIMID)

Dette er et preklinisk forskningsprosjekt og ingen pasientintervensjon er planlagt. Prosjektet benytter seg av anonymiserte humane vevsprøver kassert under radikal kirurgi. Miltorganprøvene inkludert i dette prosjektet vil være fra pasienter som gjennomgår elektiv kirurgi for en lesjon i bukspyttkjertelen i HPB-enheten ved Leicester General Hospital. Prøvestørrelsen på 24 milter er bestemt ved kraftberegninger og er i tråd med antall milter som faktisk er fjernet ved elektiv bukspyttkjertelkirurgi de siste årene. Ingen endring i kirurgisk prosedyre eller rekrutteringsresultater fra denne studien og bruken av prøvene. Alt det eksperimentelle arbeidet som utføres på miltprøvene vil ikke ha noen effekt på pasienten.

Eksperimenter inkluderer ex vivo organperfusjon og infeksjon med bakterier eller virus. Biopsier av de perfuserte 24 miltene behandles for in vitro vevsskive og makrofagcellekultur. De resulterende primære cellekulturene og vevsskivene vil bli lagret frosset for fremtidig forskning. Alle in vitro-studier på de 24 organene, og vev og cellene som stammer fra dem, vil evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner (antistoffer, reseptorantagonister, antibiotika og andre molekyler) på miltcellenes kapasitet til å fjerne invasive bakterier eller virus. Eksperimentene vil bli utført hver gang en miltprøve vil være tilgjengelig.

Den detaljerte tekniske beskrivelsen av den eksperimentelle strategien, inkludert strategien for lagring og kassering av humant vev, vil være som følger:

1. Hele organ ex vivo perfusjon: Dette arbeidet gjøres for å stabilisere organet, infisere organet og deretter utlede fra det vevsskiver og celler for primær cellekultur. Vi har med suksess satt opp en normo-termisk ex vivo porcin milt perfusjonsmodell. Denne ekspertisen tillot oss å definere parametrene for organinnsamling, transport og perfusjon av svinemilt i opptil seks timer og viktigere utvikling og infeksjonsmodell. Infeksjon viste bevaring av kapasiteten til å fjerne bakterier fra blod og god filtreringskapasitet, og, avgjørende for denne applikasjonen, at også i hele organmodellen er spesifikke undergrupper av makrofager permissive for bakteriell intracellulær replikasjon. I denne eksperimentelle serien foreslår vi å perfuse hele eksplanterte menneskelige milter. I motsetning til griser, vil vi bruke syntetisk medium for perfusjon av menneskelige organer for å nøytralisere eller minimere ervervet immunitet. Histologi, konfokalmikroskopi, FACS-analyse og bakteriell og viral opptelling vil være hovedmetodikkene for å analysere det perfuserte organet. Målet med denne delen av arbeidet er å demonstrere at bakterier og virus på hele organnivå er i stand til å replikere i miltvevsmakrofager, og påpeker oppmerksomheten til anti-infeksive behandlinger til forebygging av disse tidlige trinnene som potensielt kan forhindre invasiv bakteriell og virussykdom. Prøver fra de 24 hele perfuserte organene vil være kilden til vevsskivekulturer og primære cellekulturer.
2. Primære cellekulturer: Fra de 24 menneskelige miltene vil vi utlede prøver for primærkultur av humane vevsmakrofager og andre immunceller. Ved å bruke metodikken som er i bruk for celler fra mus og griser, vil vi sette opp primærkulturer av humane miltimmunceller og spesielt makrofager. Immunceller inkludert makrofager og nøytrofiler vil bli renset ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert percoll-gradientsentrifugering, FACS og magnetisk separasjon og dyrket i opptil syv dager. Kulturer vil bli testet for flere parametere inkludert cytokiner, overflatemarkører, enhver produksjon og genuttrykk. For å teste interaksjon med bakterier eller virus, vil de dyrkede cellene bli infisert med et panel av bakterielle og virale patogener. Ved annen metodikk vil konfokalmikroskopi, FACS og RNAseq brukes til å overvåke oppførselen til bakterielle og virale patogener og vertsceller. Intervensjoner med cytokiner, kjemokiner, medikamenter, antibiotika og andre forbindelser vil bli utført for å teste sporbarheten til systemet. Med sikte på å identifisere mål for intervensjon, er cellekulturmodellene ment å gi detaljerte kvantifiserbare parametere for interaksjonen mellom bakterier eller virus og immunceller i spesielle vevsmakrofager i et kontrollert in vitro-kultursystem. Dette er ment å tillate utforming av middels gjennomstrømningsanalyser for å teste strategier som modifiserer initiering av invasiv sykdom. Celler vil bli lagret i flytende nitrogen for videre forskning.
3. Organotypiske skivekulturer: Fra de 24 menneskelige miltene vil vi, i tillegg til celler, også utlede vevsprøver for organotypiske skivekulturer. Med metodikken godt satt opp for hjerneskiver og beskrevet for milt, vil vi dyrke organotypiske menneskelige miltskivekulturer. Disse organskivene er overlegne cellekulturer, siden de opprettholder den flercellede romlige mikroarkitekturen til organet, noe som er spesielt viktig når man analyserer vevsmakrofager. Når det gjelder hjerneskivekulturer, vil vi infisere skivene med bakterielle eller virale patogener og overvåke deres migrasjon i vevet, infeksjonen av celler og reaksjonen til enkeltvertscellene. Bruken av vevsskivekultur bør tillate spesifikt å studere den målretting og replikasjons-permissive naturen til spesifikke undergrupper av immunceller, inkludert makrofager. Et mål med målet er å tillate detaljert utvikling av infeksiøse foci i milten, inkludert tidsrunde konfokal mikroskopi av infiserte miltskiver. Testing i denne modellen cytokiner og andre vertsavledede molekyler forventes å vise potensialet til intervensjoner rettet mot spesifikke undergrupper av immunceller, inkludert makrofager. Vevsskiver vil bli lagret i flytende nitrogen for videre forskning.

Prøveoverføring mellom enheter: De 24 planlagte organperfusjonene vil bli utført ved laboratoriene til HBP-enheten ved Leicester General Hospital. I utvalgte tilfeller kan organperfusjon utføres ved Institutt for genetikk og genombiologi ved University of Leicester. Den relative HBA-formen er oppnådd (Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cellelinjer og primær human celle- og vevskultur, dato 02/10/2017). Under og etter perfusjon vil det bli tatt vevsprøver for vevsskivekultur og primær cellekultur. Disse vevsprøvene vil bli overført til Institutt for genetikk og genombiologi eller Institutt for infeksjon og immunitet og betennelse for det planlagte forskningsarbeidet og vil bli oppbevart der i henhold til forskrifter knyttet til lov om humant vev. Lagrede vevsskiver og primære cellekulturer kan deretter overføres for immunologiske studier til University of Nottingham for eksperimentelt arbeid beskrevet ovenfor for cellekulturer. Vilkår for håndtering, lagring og transport er definert av HBA-skjemaet GEN45 og overføring vil bli regulert av en MTA.