Modèles tissulaires pour maladies invasives (TIMID) (TIMID)

Il s'agit d'un projet de recherche préclinique et aucune intervention du patient n'est prévue. Le projet utilise des échantillons de tissus humains anonymisés rejetés lors d'une chirurgie radicale. Les échantillons d'organes spléniques inclus dans ce projet proviendront de patients subissant une chirurgie élective pour une lésion du pancréas dans l'unité HPB de l'hôpital général de Leicester. La taille de l'échantillon de 24 rates a été déterminée par des calculs de puissance et correspond au nombre de rates réellement retirées par chirurgie élective du pancréas au cours des dernières années. Aucun changement dans la procédure chirurgicale ou les résultats de recrutement de cette étude et de l'utilisation des échantillons. Tous les travaux expérimentaux effectués sur les échantillons de rate n'auront aucun effet sur le patient.

Les expériences comprennent la perfusion d'organes ex vivo et l'infection par des bactéries ou des virus. Des biopsies des 24 rates perfusées sont traitées pour une coupe de tissu in vitro et une culture de cellules macrophages. Les cultures de cellules primaires et les tranches de tissus qui en résultent seront conservées congelées pour de futures recherches. Toutes les études in vitro sur les 24 organes, et les tissus et cellules qui en sont dérivés, évalueront l'effet des interventions thérapeutiques (anticorps, antagonistes des récepteurs, antibiotiques et autres molécules) sur la capacité des cellules spléniques à éliminer les bactéries ou virus invasifs. Les expériences seront réalisées chaque fois qu'un échantillon de rate sera disponible.

La description technique détaillée de la stratégie expérimentale, y compris la stratégie de stockage et d'élimination des tissus humains, sera la suivante :

1. Perfusion ex vivo d'un organe entier : ce travail est effectué pour stabiliser l'organe, infecter l'organe, puis en tirer des tranches de tissu et des cellules pour la culture cellulaire primaire. Nous avons mis en place avec succès un modèle normo-thermique ex vivo de perfusion de rate porcine. Cette expertise nous a permis de définir les paramètres de prélèvement d'organes, de transport et de perfusion de la rate porcine jusqu'à six heures et surtout de développer un modèle d'infection. L'infection a montré la conservation de la capacité à éliminer les bactéries du sang et une bonne capacité de filtrage et, ce qui est essentiel pour cette application, également dans l'ensemble du modèle d'organe, des sous-ensembles spécifiques de macrophages sont permissifs à la réplication intracellulaire bactérienne. Dans cette série expérimentale nous proposons de perfuser des rates humaines entières explantées. Contrairement aux porcs, on utilisera pour la perfusion de l'organe humain un milieu synthétique afin de neutraliser ou minimiser l'immunité acquise. L'histologie, la microscopie confocale, l'analyse FACS et la numération bactérienne et virale seront les principales méthodologies d'analyse de l'organe perfusé. L'objectif de cette partie du travail est de démontrer qu'au niveau de l'ensemble de l'organe, les bactéries et les virus sont capables de se répliquer dans les macrophages du tissu splénique, soulignant l'attention des traitements anti-infectieux sur la prévention de ces premières étapes potentiellement prévenant les maladies bactériennes et virales invasives. Des échantillons provenant des 24 organes entiers perfusés seront la source de cultures de tranches de tissus et de cultures de cellules primaires.
2. Cultures cellulaires primaires : à partir des 24 rates humaines, nous prélèverons des échantillons pour la culture primaire de macrophages de tissus humains et d'autres cellules immunitaires. En utilisant la méthodologie en usage pour les cellules de souris et de porc, nous mettrons en place des cultures primaires de cellules immunitaires spléniques humaines et en particulier de macrophages. Les cellules immunitaires, y compris les macrophages et les neutrophiles, seront purifiées par différentes méthodologies, notamment par centrifugation en gradient de percoll, FACS et séparation magnétique, et cultivées jusqu'à sept jours. Les cultures seront testées pour de multiples paramètres, y compris les cytokines, les marqueurs de surface, la production de n'importe qui et l'expression des gènes. Pour tester l'interaction avec des bactéries ou des virus, les cellules cultivées seront infectées par un panel de pathogènes bactériens et viraux. Sur une autre méthodologie, la microscopie confocale, le FACS et le RNAseq seront utilisés pour surveiller le comportement des agents pathogènes bactériens et viraux et des cellules hôtes. Des interventions avec des cytokines, des chimiokines, des médicaments, des antibiotiques et d'autres composés seront effectuées pour tester la traçabilité du système. Dans le but d'identifier des cibles d'intervention, les modèles de culture cellulaire sont destinés à fournir des paramètres quantifiables détaillés de l'interaction des bactéries ou virus et des cellules immunitaires en particulier des macrophages tissulaires dans un système de culture in vitro contrôlé. Ceci est destiné à permettre la conception d'essais à moyen débit pour tester des stratégies modifiant l'initiation d'une maladie invasive. Les cellules seront stockées dans de l'azote liquide pour des recherches ultérieures.
3. Cultures de tranches organotypiques : À partir des 24 rates humaines, nous dériverons, en plus des cellules, également des échantillons de tissus pour les cultures de tranches organotypiques. Avec la méthodologie bien établie pour les tranches de cerveau et décrite pour la rate, nous cultiverons des cultures de tranches de rate humaine organotypiques. Ces tranches d'organes sont supérieures aux cultures cellulaires, car elles maintiennent la microarchitecture spatiale multicellulaire de l'organe, ce qui est particulièrement important lors de l'analyse des macrophages tissulaires. En ce qui concerne les cultures de tranches de cerveau, nous infecterons les tranches avec des agents pathogènes bactériens ou viraux et surveillerons leur migration dans le tissu, l'infection des cellules et la réaction des cellules hôtes individuelles. L'utilisation de la culture de tranches de tissus devrait permettre d'étudier spécifiquement le ciblage et la nature permissive à la réplication de sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, y compris les macrophages. Un but de l'objectif est de permettre le développement détaillé de foyers infectieux dans la rate, y compris la microscopie confocale de tours de temps de tranches de rate infectées. Les tests dans ce modèle de cytokines et d'autres molécules dérivées de l'hôte devraient montrer le potentiel d'interventions ciblant des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, y compris les macrophages. Les tranches de tissus seront stockées dans de l'azote liquide pour des recherches ultérieures.

Transfert d'échantillons entre unités : Les 24 perfusions d'organes prévues seront réalisées dans les laboratoires de l'unité HBP du Leicester General Hospital. Dans certains cas, la perfusion d'organes peut être effectuée au Département de génétique et de biologie du génome de l'Université de Leicester. La forme HBA relative a été obtenue (Hazardous Biological Agents form GEN/45 Cell lines and primary human cell and tissue culture, date 02/10/2017). Pendant et après la perfusion, des échantillons de tissus pour la culture de tranches de tissu et la culture de cellules primaires seront prélevés. Ces échantillons de tissus seront transférés au Département de Génétique et Biologie du Génome ou Département d'Infection et Immunité et Inflammation pour les travaux de recherche programmés et y seront conservés conformément à la réglementation relative à la loi sur les tissus humains. Les tranches de tissu stockées et les cultures de cellules primaires peuvent ensuite être transférées pour des études immunologiques à l'Université de Nottingham pour des travaux expérimentaux détaillés ci-dessus pour les cultures cellulaires. Les conditions de manutention, de stockage et de transport sont définies par le formulaire HBA GEN45 et le transfert sera réglementé par un MTA.