ゼブラフィッシュ胚モデルを使用した CRLM 患者の腫瘍増殖と腫瘍治療の評価 (CRLM-Z)

個別化された腫瘍学的治療を調整するために、消化管悪性腫瘍を有する個々の患者の腫瘍学的腫瘍反応を予測する可能性は、現在のところ限られています。 これは、腫瘍治療を決定するために使用される情報のほとんどが、個人ではなく患者のグループに関係することを意味します。 同様に、使用される化学療法レジメンのほとんどは個別に調整されていませんが、特定の患者コホートには有益であることが示されています。 結腸直腸癌では、KRAS (Kirsten ラット肉腫) と BRAF の変異状態は、EGFR/KRAS/BRAF シグナル伝達経路のさまざまな段階を標的とする薬剤に対する反応を予測しますが、MSI/MMR の状態は、免疫チェックポイント阻害剤の結果を予測する可能性があります [1]。 化学療法やその他のがん治療には重篤な副作用があるため、治療が無効になるだけでなく、重篤な有害事象を引き起こし、患者の寿命を縮め、根治的な腫瘍切除の可能性を阻害することさえあります。 このため、ゼブラフィッシュのアバター モデルにおける治療前の反応評価は、最も価値があります。

臨床的観点から、最も簡単な状況はアジュバント設定です。 この時点で、腫瘍全体を分析に使用でき、より大きな組織片をアバター モデルで使用できます。 5-フルオロウラシルまたはカペシタビン (5-FU プロドラッグ) 単独またはオキサリプラチンとの併用は、2 つ以上の危険因子を伴うステージ III 結腸癌およびステージ II 結腸癌における現在の標準補助療法です。 他のタイプの併用レジメン。 イリノテカンはこれまでのところ、アジュバントの状況で利益を示すことができませんでした.

ネオアジュバント設定、すなわち切除可能な CRLM 患者に対する術前治療では、5-FU (またはカペシタビン) とオキサリプラチンまたはイリノテカンのいずれかの併用により、手術の転帰および長期予後が改善される可能性があります。 現在、個々の患者にとってどのレジメンが最も効果的かはわかっていません。

患者が切除不能な CRLM を呈する最も重篤なシナリオでは、緩和化学療法またはダウンサイジング/転換化学療法のいずれかが適応となります。 後者の患者グループの場合、最初の行で可能な限り強力な治療を提供することが最も重要です。

治療域は狭く、一次治療でさらに臨床的および/または放射線学的に進行すると、さらなる腫瘍学的および外科的介入が妨げられる可能性があります。 健康な患者は、5-FU、オキサリプラチン、およびイリノテカンのトリプレット（FOLFOXIRI）の恩恵を受ける可能性があります。 ただし、これは有毒なレジメンであり、高齢または体力のない患者には、5-FU の 2 剤とオキサリプラチンまたはイリノテカンのいずれかが提供されることがより一般的です。 化学療法が VEGF を標的とする抗体と組み合わされた場合、または野生型 KRAS を発現する腫瘍の場合は EGF 受容体と組み合わされた場合、さらなる価値が得られる可能性があります。

しかし、切除不能な腫瘍量を事前に抱えている患者にとって最も価値のある設定は、治療が開始される前でしょう。

結腸直腸がん患者の最大 50% が、原発腫瘍の検出に関連して同時性または異時性の肝転移を発症します [2]。 今日の治療の主力は、術前の肝容積増大の有無にかかわらず、転移の切除 +/- アブレーションと、場合によっては抗体と組み合わせた化学療法の組み合わせです [3]。

腫瘍の成長だけでなく、腫瘍内の発癌遺伝子のパターンにおいても、多くの予後不良因子が特定されています[4]。 それでもなお、最も重要な要因の 1 つは、化学療法に対する転移の放射線学的反応と、腫瘍マーカー (CEA、CA19/9) の減少の両方における反応です [5, 6]。

転移が与えられた治療に反応するかどうかについては、まだほとんどわかっていません。 KRAS 変異を有する腫瘍はアービタックス治療に反応せず、粘液性腫瘍は通常、化学療法に対してより耐性があります[7]。

治療に対する腫瘍特異的な反応を評価するためにさまざまなモデルが検討されてきましたが、そのほとんどは遅いか、さまざまな結果を示しています [8]。 今日、マウス患者由来異種移植片 (PDX) モデルは、治療に対する反応を予測するために最も使用され、検証されていますが、腫瘍治療の評価には数か月かかります [9]。 したがって、マウス PDX モデルは臨床上の意思決定には使用できません。 患者由来のがんを使用したオルガノイド培養は、よく使用される in vitro スクリーニング ツールであり、さまざまな腫瘍で有望な結果が得られます [10]。 オルガノイドは、元の腫瘍組織の遺伝的特徴を維持します。 それでも、これらのモデルは、治療決定のための患者の組織の評価に関しては遅く、転移性または血管新生の可能性を評価する能力に欠けています.

最近では、ゼブラフィッシュの胚がヒトの癌のアバターとして使用されています。最初は血行性癌でしたが、最近では PDAC、乳癌、結腸直腸癌などの固形癌でも使用されています [11-14]。

このモデルにはいくつかの利点があります。最も強力なのは、腫瘍組織が胚に移植されてからわずか 3 ～ 5 日後の応答評価です。 胚は透明であるため、腫瘍の成長と広がりを詳細に視覚化し、半自動で定量化することができます[15]。 ゼブラフィッシュの胚自体の免疫系は 8 日目まで応答しないため [14]、腫瘍に対する免疫応答が患者自身の免疫細胞から生じる理由は、このモデルで異種移植移植が機能する理由でもあります。 一方で。 これまでのところ、生検組織は十分ではありませんが、これらのアバターを生成するには、少なくとも 1 立方センチメートルの腫瘍組織が必要です。 このため、針生検は十分な材料を提供していませんが、現在のプロトコルでは切除された肝腫瘍組織が必要です。

ゼブラフィッシュの胚では、結腸直腸癌細胞が増殖することが示されており、さまざまな化学療法の組み合わせの反応評価が成功しており、ヒトの反応と非常によく相関しています[14]。 結腸直腸肝転移に関する臨床研究はこれまで実施されていません。

魚は、14:10 時間の明暗サイクルの再循環システムで 28 ° C の平均温度で収容されます。 ゼブラフィッシュの受精卵は、当社の施設で野生型 AB 株の自然交配によって得られ、発生中の胚は、Kimmel ら [19] に従って 28 ° C のインキュベーターで上演されます。 任意の手順の前に、胚は 0.02% トリカインで麻酔されます。 組織病理学者によって外科標本から採取された腫瘍組織は、凍結保存培地を含むクライオチューブに組織を沈め、チューブをクライオボックスに追加し、ボックスを-80度の冷凍庫に少なくとも24時間置くことによって凍結保存されます。 次に、組織を含むチューブをドライアイスでゼブラフィッシュ実験室に輸送し、そこで組織を解凍し、洗浄し、機械的分解装置（GentleMACS）内のプロテアーゼミックスでインキュベートして、組織から単一細胞懸濁液を生成します。 懸濁液を濾過し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の40μg/mL CM-Dilで30分間インキュベートし、続いて遠心分離し、PBSで洗浄する。 標識された細胞は、その後、移植培地に再懸濁され、2日齢のゼブラフィッシュ胚の皮下囲卵区画に細いガラスキャピラリー針を使用して注入されます。 正常に移植されたゼブラフィッシュ胚は、調査中の薬物 (例えば、サンプルを寄付した患者の治療に考慮される可能性のある薬物) を含む胚培地に移され、3 日間処理されます。 腫瘍の画像は、移植直後と 3 日間の治療期間後の両方で取得され、3 日間の治療期間後にゼブラフィッシュ胚の主な転移部位の追加画像が取得され、細胞の転移能力が評価されます。 治療結果は、ビヒクル対照群と比較した治療群の3日目から0日目までの腫瘍体積の変化（パーセント）として評価され、治療群の腫瘍体積の有意に強い減少は、肯定的な治療結果と見なされます. 転移促進性表現型の証拠は、移植の 3 日後にゼブラフィッシュ胚の転移部位で見つかった細胞の数から導き出されます。 患者の転移進行の可能性を予測するために必要な転移細胞の数のカットオフレベルは、そのような情報が現在他の情報源から入手できないため、含まれる最初の10〜20人の患者で評価されます。