Evaluación del crecimiento tumoral y tratamiento oncológico en pacientes con CRLM utilizando el modelo de embrión de pez cebra (CRLM-Z)

Actualmente, las posibilidades de predecir la respuesta del tumor oncológico para pacientes individuales con neoplasias malignas gastrointestinales para adaptar un tratamiento oncológico personalizado son limitadas. Esto significa que la mayor parte de la información que se utiliza para decidir el tratamiento oncológico pertenece a un grupo de pacientes y no a individuos. De manera similar, la mayoría de los regímenes de quimioterapia utilizados no se adaptan individualmente, aunque se ha demostrado que son beneficiosos para ciertas cohortes de pacientes. En el cáncer colorrectal, el estado de mutación de KRAS (Kirsten rat sarcoma) y BRAF predice la respuesta a los fármacos que se dirigen a varios pasos en la vía de señalización de EGFR/KRAS/BRAF, mientras que el estado de MSI/MMR puede predecir el resultado de los inhibidores del punto de control inmunitario [1]. Dado que la quimioterapia, así como otros tratamientos contra el cáncer, pueden tener efectos secundarios graves, el tratamiento no solo puede ser ineficaz, sino que también puede causar efectos adversos graves, incluso acortando la vida del paciente e inhibiendo la posibilidad de una resección tumoral curativa. Por esta razón, la evaluación de la respuesta previa al tratamiento en un modelo avatar de pez cebra sería muy valiosa.

Desde un punto de vista clínico, la situación más fácil es en el entorno adyuvante. En este punto, todo el tumor está disponible para el análisis y se pueden usar piezas de tejido más grandes en el modelo de avatar. El 5-fluorouracilo o la capecitabina (un profármaco de 5-FU) solos o en combinación con oxaliplatino es el tratamiento adyuvante estándar actual en el cáncer de colon en estadio III y en el cáncer de colon en estadio II con más de 2 factores de riesgo. Otros tipos de regímenes combinados que incluyen, p. el irinotecán hasta ahora no ha demostrado beneficio en la situación adyuvante.

En el entorno neoadyuvante, es decir, el tratamiento preoperatorio de pacientes con CRLM resecable, las combinaciones de 5-FU (o capecitabina) y oxaliplatino o irinotecán pueden mejorar el resultado de la cirugía y el pronóstico a largo plazo. Actualmente no se sabe qué régimen es más eficiente para el paciente individual.

En el escenario más grave, donde el paciente presenta CRLM irresecable, está indicada la quimioterapia paliativa o la quimioterapia de reducción/conversión. Para este último grupo de pacientes, es de suma importancia proporcionar un tratamiento lo más potente posible en la primera línea, ya que los 10

La ventana terapéutica es estrecha y una mayor progresión clínica y/o radiológica en la terapia de primera línea puede impedir futuras intervenciones oncológicas y quirúrgicas. Los pacientes en forma pueden beneficiarse de un triplete de 5-FU, oxaliplatino e irinotecán (FOLFOXIRI). Sin embargo, este es un régimen tóxico, ya los pacientes mayores o menos aptos se les ofrece más comúnmente un doblete de 5-FU y oxaliplatino o irinotecán. Puede haber un valor adicional cuando la quimioterapia se combina con anticuerpos dirigidos a VEGF o, para aquellos tumores que expresan KRAS de tipo salvaje, el receptor de EGF.

Pero quizás el escenario más valioso para el paciente con una carga tumoral inicial no resecable sería antes de que se haya iniciado cualquier tratamiento.

Hasta el 50% de los pacientes con cáncer colorrectal desarrollarán metástasis hepáticas sincrónicas o metacrónicas en relación con la detección del tumor primario[2]. El pilar del tratamiento actual es una combinación de resección +/- ablación de metástasis, con o sin aumento preoperatorio del volumen hepático y quimioterapia, a veces en combinación con anticuerpos[3].

Se han identificado una serie de factores pronósticos negativos tanto en el crecimiento tumoral como en el patrón de oncogenes en los tumores[4]. Aún así, uno de los factores más importantes es la respuesta de las metástasis a la quimioterapia tanto radiológicamente como en la reducción de marcadores tumorales (CEA, CA19/9)[5, 6].

Todavía tenemos muy poco conocimiento si las metástasis van a responder a la terapia dada o no. El tumor con mutación KRAS no responderá al tratamiento con Erbitux, y los tumores mucinosos suelen ser más resistentes a cualquier quimioterapia[7].

Se han explorado diferentes modelos para evaluar la respuesta específica del tumor al tratamiento, pero la mayoría son lentos o han mostrado resultados mixtos[8]. Hoy en día, el modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de ratón es el más utilizado y validado para predecir la respuesta a la terapia, pero la evaluación de la terapia oncológica lleva meses [9]. Por lo tanto, el modelo PDX de ratón no se puede utilizar para la toma de decisiones clínicas. Los cultivos de organoides que utilizan cánceres derivados de pacientes son una herramienta de detección in vitro muy utilizada, con resultados prometedores para diferentes tumores [10]. Los organoides mantienen las características genéticas del tejido tumoral original. Aún así, estos modelos son lentos cuando se trata de evaluar el tejido de los pacientes para decisiones de tratamiento y carecen de la capacidad de evaluar potenciales metastásicos o angiogénicos.

Recientemente, los embriones de pez cebra se han utilizado como avatares para el cáncer humano, primero en cánceres hematógenos, pero últimamente también en cánceres sólidos como PDAC, cáncer de mama y cáncer colorrectal [11-14].

El modelo tiene varias ventajas, la más fuerte es la evaluación de la respuesta solo 3-5 días después de que el tejido tumoral se implanta en los embriones. Los embriones son transparentes, por lo que el crecimiento y la propagación del tumor se pueden visualizar en detalle y cuantificar de forma semiautomática[15]. Como el propio sistema inmunitario de los embriones de pez cebra no responde hasta el día 8 [14], por qué la respuesta inmunitaria contra el tumor proviene de las propias células inmunitarias del paciente, esta es también la razón por la que el injerto de xenoinjerto funciona en este modelo. Por otro lado. Hasta ahora, el tejido de biopsia no es suficiente, pero se necesita al menos un centímetro cúbico de tejido tumoral para generar estos avatares. Por esta razón, las biopsias con aguja no proporcionan suficiente material, pero los protocolos actuales necesitan tejidos tumorales hepáticos resecados.

En embriones de pez cebra, se ha demostrado que las células de cáncer colorrectal crecen y la evaluación de la respuesta de diferentes combinaciones de quimioterapia ha tenido éxito con una muy buena correlación con la respuesta en humanos [14]. Hasta el momento no se han realizado estudios clínicos sobre metástasis hepáticas colorrectales.

Los peces se alojan a una temperatura media de 28 °C en un sistema de recirculación con un ciclo de luz a oscuridad de 14:10 h. Los huevos fertilizados de pez cebra se obtienen mediante el apareamiento natural de la cepa AB de tipo salvaje en nuestras instalaciones y los embriones en desarrollo se estadifican en una incubadora a 28 °C según Kimmel et al [19]. Antes de cualquier procedimiento, los embriones serán anestesiados en tricaína al 0,02%. El tejido tumoral extraído de la muestra quirúrgica por el histopatólogo se crioconserva sumergiendo el tejido en criotubos que contienen medio de crioconservación, agregando los tubos a una caja criogénica y colocando la caja en un congelador a -80 grados durante al menos 24 horas. Luego, el tubo con el tejido se transporta en hielo seco al laboratorio de pez cebra, donde el tejido se descongelará, lavará e incubará en una mezcla de proteasa dentro de un dispositivo de desagregación mecánica (GentleMACS), para producir una suspensión de una sola célula a partir del tejido. La suspensión se filtra y se incuba durante 30 min en 40 μg/ml de CM-Dil en solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de centrifugación y lavado con PBS. A continuación, las células marcadas se resuspenden en medio de implantación y se inyectan con agujas capilares de vidrio fino en el compartimento perivitelino subcutáneo de embriones de pez cebra de 2 días de edad. Los embriones de pez cebra implantados con éxito se transfieren a un medio embrionario que contiene los medicamentos bajo investigación (por ejemplo, los medicamentos que podrían considerarse para el tratamiento del paciente que dona la muestra) y se tratan durante tres días. Las imágenes de los tumores se adquieren inmediatamente después del trasplante y después del período de tratamiento de tres días, y se adquiere una imagen adicional del sitio metastásico principal en el embrión de pez cebra después del período de tratamiento de tres días para evaluar las capacidades metastásicas de las células. El resultado del tratamiento se evaluará como el cambio en el volumen del tumor entre el día 3 y el día 0 en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control del vehículo (porcentaje), y una reducción significativamente mayor de los volúmenes del tumor en el grupo de tratamiento se considerará como un resultado positivo del tratamiento. . La evidencia de un fenotipo pro-metastásico se derivará del número de células encontradas en el sitio metastásico en los embriones de pez cebra tres días después de la implantación. Los niveles de corte para cuántas células metastásicas se requieren para predecir la probable progresión metastásica en el paciente se evaluarán en los primeros 10 a 20 pacientes incluidos, ya que dicha información no está disponible actualmente de otras fuentes de información.