Evaluatie van tumorgroei en oncologische behandeling bij patiënten met CRLM met behulp van het Zebra Fish Embryo-model (CRLM-Z)

De mogelijkheden om de oncologische tumorrespons van individuele patiënten met gastro-intestinale maligniteiten te voorspellen om een ​​gepersonaliseerde oncologische behandeling op maat te maken, zijn momenteel beperkt. Dit betekent dat de meeste informatie die wordt gebruikt om te beslissen over een oncologische behandeling betrekking heeft op een groep patiënten en niet op individuen. Evenzo zijn de meeste gebruikte chemotherapieregimes niet individueel aangepast, hoewel is aangetoond dat het gunstig is voor bepaalde cohorten patiënten. Bij colorectale kanker voorspellen KRAS (Kirsten rat sarcoom) en BRAF-mutatiestatus de respons op geneesmiddelen die gericht zijn op verschillende stappen in de EGFR/KRAS/BRAF-signaalroute, terwijl de MSI/MMR-status de uitkomst van immuuncontrolepuntremmers kan voorspellen [1]. Aangezien chemotherapie, evenals andere kankerbehandelingen, ernstige bijwerkingen kunnen hebben, kan de behandeling niet alleen ineffectief zijn, maar ook ernstige bijwerkingen veroorzaken die zelfs het leven van de patiënt verkorten en de kans op curatieve tumorresectie remmen. Om deze reden zou evaluatie van de respons vóór de behandeling in een avatarmodel van de zebravis zeer waardevol zijn.

Vanuit klinisch oogpunt is de gemakkelijkste situatie in de adjuvante setting. Op dit punt is de hele tumor beschikbaar voor analyse en kunnen grotere stukken weefsel worden gebruikt in het avatarmodel. 5-fluorouracil of capecitabine (een 5-FU-prodrug), alleen of in combinatie met oxaliplatine, is de huidige standaard adjuvante behandeling bij stadium III colonkanker en stadium II colonkanker met 2+ risicofactoren. Andere soorten combinatieregimes, waaronder b.v. irinotecan heeft tot nu toe geen voordeel opgeleverd in de adjuvante situatie.

In de neoadjuvante setting, d.w.z. preoperatieve behandeling van patiënten met resectabele CRLM, kunnen combinaties van 5-FU (of capecitabine) en oxaliplatine of irinotecan het resultaat van een operatie en de langetermijnprognose verbeteren. Het is momenteel niet bekend welk regime het meest efficiënt is voor de individuele patiënt.

In het meest ernstige scenario, waarbij de patiënt zich presenteert met inoperabele CRLM, is palliatieve chemotherapie of downsizing/conversiechemotherapie geïndiceerd. Voor die laatste groep patiënten is het van het grootste belang om in de eerste lijn een zo krachtig mogelijke behandeling te geven, aangezien de 10

Het therapeutisch venster is smal en verdere klinische en/of radiologische progressie tijdens de eerstelijnsbehandeling kan verdere oncologische en chirurgische ingrepen uitsluiten. Geschikte patiënten kunnen baat hebben bij een triplet van 5-FU, oxaliplatine en irinotecan (FOLFOXIRI). Dit is echter een toxisch regime en oudere of minder fitte patiënten krijgen vaker een doublet van 5-FU en oxaliplatine of irinotecan aangeboden. Er kan een toegevoegde waarde zijn wanneer de chemotherapie wordt gecombineerd met antilichamen gericht tegen VEGF of, voor die tumoren die wildtype KRAS tot expressie brengen, de EGF-receptor.

Maar misschien is de meest waardevolle setting voor de patiënt met vooraf niet-reseceerbare tumorlast, voordat een behandeling is gestart.

Tot 50% van de patiënten met dikkedarmkanker ontwikkelt levermetastasen ofwel synchroon ofwel metachroon in relatie tot de detectie van de primaire tumor[2]. De steunpilaar van de huidige behandeling is een combinatie van resectie +/-ablatie van metastasen, met of zonder preoperatieve levervolumevergroting en chemotherapie, soms in combinatie met antilichamen[3].

Er zijn een aantal negatieve prognostische factoren geïdentificeerd, zowel met betrekking tot de tumorgroei als met betrekking tot het patroon van oncogenen in de tumoren[4]. Toch is een van de belangrijkste factoren de respons van de metastasen op chemotherapie, zowel radiologisch als wat betreft de reductie van tumormarkers (CEA, CA19/9)[5, 6].

Toch weten we heel weinig of de uitzaaiingen zullen reageren op de gegeven therapie of niet. Tumoren met KRAS-mutatie reageren niet op behandeling met Erbitux, en mucineuze tumoren zijn meestal beter bestand tegen chemotherapie[7].

Er zijn verschillende modellen onderzocht om de tumorspecifieke respons op de behandeling te evalueren, maar de meeste zijn traag of hebben gemengde resultaten opgeleverd[8]. Tegenwoordig is het muispatiënt-afgeleide xenotransplantaat (PDX) -model het meest gebruikt en gevalideerd om de respons op therapie te voorspellen, maar de evaluatie van oncologische therapie duurt maanden [9]. Daarom kan het muis-PDX-model niet worden gebruikt voor klinische besluitvorming. Organoïde kweken waarbij gebruik wordt gemaakt van kanker afkomstig van de patiënt is een veelgebruikt instrument voor in-vitroscreening, met veelbelovende resultaten voor verschillende tumoren[10]. Organoïden behouden de genetische kenmerken van het oorspronkelijke tumorweefsel. Toch zijn deze modellen traag als het gaat om het evalueren van het weefsel van patiënten voor behandelbeslissingen en missen ze het vermogen om metastatische of angiogene mogelijkheden te evalueren.

Onlangs zijn zebravisembryo's gebruikt als avatars voor kanker bij de mens, eerst bij hematogene kankers, maar de laatste tijd ook bij solide kankers zoals PDAC, borstkanker en colorectale kanker [11-14].

Het model heeft verschillende voordelen, de sterkste is responsevaluatie slechts 3-5 dagen nadat het tumorweefsel in de embryo's is geïmplanteerd. De embryo's zijn transparant, zodat tumorgroei en -verspreiding in detail gevisualiseerd en semi-automatisch gekwantificeerd kan worden[15]. Aangezien het eigen immuunsysteem van de zebravisembryo's pas op dag 8 reageert [14], waarom de immuunrespons tegen de tumor afkomstig is van de eigen immuuncellen van de patiënt, is dit ook de reden waarom xenograft-implantatie in dit model werkt. Anderzijds. Tot nu toe is biopsieweefsel niet genoeg, maar er is minstens een kubieke centimeter tumorweefsel nodig om deze avatars te genereren. Om deze reden leveren naaldbiopten niet genoeg materiaal op, maar zijn in de huidige protocollen gereseceerde levertumorweefsels nodig.

In zebravisembryo's is aangetoond dat colorectale kankercellen groeien en responsevaluatie van verschillende combinaties van chemotherapie is succesvol geweest met een zeer goede correlatie met de respons bij mensen [14]. Klinische studies naar colorectale levermetastasen zijn tot nu toe niet uitgevoerd.

Vissen worden gehuisvest bij een gemiddelde temperatuur van 28 °C in een recirculatiesysteem met een licht-donkercyclus van 14:10 uur. Zebravis bevruchte eieren worden verkregen door natuurlijke paring van wild-type AB-stam in onze faciliteiten en de zich ontwikkelende embryo's worden in een incubator bij 28 °C geënsceneerd volgens Kimmel et al[19]. Vóór elke procedure worden de embryo's verdoofd in 0,02% tricaïne. Het tumorweefsel dat door de histopatholoog uit het chirurgische monster is genomen, wordt gecryopreserveerd door het weefsel onder te dompelen in cryobuisjes met cryoconserveringsmedium, de buisjes toe te voegen aan een cryobox en de doos gedurende ten minste 24 uur in een vriezer van -80 graden te plaatsen. De buis met weefsel wordt vervolgens op droogijs naar het zebravislaboratorium getransporteerd, waar het weefsel wordt ontdooid, gewassen en geïncubeerd in een proteasemengsel in een mechanisch desaggregatie-apparaat (GentleMACS), om een ​​enkele celsuspensie uit het weefsel te produceren. De suspensie wordt gefiltreerd en gedurende 30 minuten geïncubeerd in 40 ug/ml CM-Dil in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door centrifugatie en wassen met PBS. De gelabelde cellen worden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in implantatiemedium en geïnjecteerd met behulp van dunne glazen capillaire naalden in het subcutane perivitellinecompartiment van 2 dagen oude zebravisembryo's. Succesvol geïmplanteerde zebravisembryo's worden vervolgens overgebracht naar embryomedium dat de geneesmiddelen bevat die worden onderzocht (bijv. de geneesmiddelen die in aanmerking kunnen komen voor de behandeling van de patiënt die het monster doneert) en gedurende drie dagen worden behandeld. Beelden van de tumoren worden zowel onmiddellijk na transplantatie als na de behandelingsperiode van drie dagen verkregen, en na de behandelingsperiode van drie dagen wordt een aanvullend beeld van de belangrijkste metastatische plaats in het zebravisembryo verkregen om de metastatische capaciteiten van de cellen te evalueren. Het resultaat van de behandeling zal worden geëvalueerd als verandering in het tumorvolume tussen dag 3 en dag 0 in de behandelingsgroep in vergelijking met de vehiculumcontrolegroep (percentage), en een significant sterkere afname van het tumorvolume in de behandelingsgroep zal worden beschouwd als een positief behandelingsresultaat . Bewijs van een pro-metastatisch fenotype zal worden afgeleid uit het aantal cellen dat drie dagen na implantatie op de metastatische plaats in de zebravisembryo's wordt aangetroffen. Afkapniveaus voor het aantal gemetastaseerde cellen dat nodig is om waarschijnlijke metastatische progressie bij de patiënt te voorspellen, zullen worden geëvalueerd bij de eerste 10-20 opgenomen patiënten, aangezien dergelijke informatie momenteel niet beschikbaar is uit andere informatiebronnen.