Valutazione della crescita tumorale e del trattamento oncologico in pazienti con CRLM utilizzando il modello di embrione di pesce zebra (CRLM-Z)

Le possibilità di prevedere la risposta del tumore oncologico per i singoli pazienti con neoplasie gastrointestinali al fine di personalizzare un trattamento oncologico personalizzato sono attualmente limitate. Ciò significa che la maggior parte delle informazioni utilizzate per decidere sul trattamento oncologico riguarda un gruppo di pazienti piuttosto che individui. Allo stesso modo, la maggior parte dei regimi chemioterapici utilizzati non è adattata individualmente, sebbene sia stato dimostrato che è vantaggioso per alcune coorti di pazienti. Nel carcinoma del colon-retto, lo stato di mutazione KRAS (sarcoma di ratto di Kirsten) e BRAF predicono la risposta ai farmaci mirati a vari passaggi nella via di segnalazione EGFR/KRAS/BRAF, mentre lo stato MSI/MMR può predire l'esito degli inibitori del checkpoint immunitario [1]. Poiché la chemioterapia, così come altri trattamenti antitumorali, può avere gravi effetti collaterali, il trattamento può non solo essere inefficace, ma può anche causare gravi eventi avversi, anche accorciando la vita del paziente e inibendo la possibilità di una resezione curativa del tumore. Per questo motivo, la valutazione della risposta pre-trattamento in un modello avatar di zebrafish sarebbe molto preziosa.

Da un punto di vista clinico la situazione più semplice è nel setting adiuvante. A questo punto l'intero tumore è disponibile per l'analisi e pezzi di tessuto più grandi possono essere utilizzati nel modello avatar. Il 5-fluorouracile o la capecitabina (un profarmaco 5-FU) da soli o in combinazione con oxaliplatino è l'attuale trattamento adiuvante standard nel cancro del colon in stadio III e nei tumori del colon in stadio II con 2+ fattori di rischio. Altri tipi di regimi di combinazione inclusi ad es. irinotecan finora non ha mostrato benefici nella situazione adiuvante.

Nell'impostazione neoadiuvante, vale a dire il trattamento preoperatorio di pazienti con CRLM resecabile, le combinazioni di 5-FU (o capecitabina) e oxaliplatino o irinotecan possono migliorare l'esito dell'intervento chirurgico e la prognosi a lungo termine. Al momento non è noto quale sia il regime più efficace per il singolo paziente.

Nello scenario più grave, in cui il paziente presenta un CRLM non resecabile, è indicata la chemioterapia palliativa o la chemioterapia di riduzione/conversione. Per quest'ultimo gruppo di pazienti, è della massima importanza fornire il trattamento più potente possibile in prima linea, poiché il 10

La finestra terapeutica è ristretta e un'ulteriore progressione clinica e/o radiologica sulla terapia di prima linea può precludere ulteriori interventi oncologici e chirurgici. I pazienti in forma possono beneficiare di una tripletta di 5-FU, oxaliplatino e irinotecan (FOLFOXIRI). Tuttavia, questo è un regime tossico e ai pazienti più anziani o meno in forma viene più comunemente offerto un doppietto di 5-FU e oxaliplatino o irinotecan. Potrebbe esserci un valore aggiunto quando la chemioterapia è combinata con anticorpi mirati al VEGF o, per quei tumori che esprimono KRAS wild type, al recettore EGF.

Ma forse l'impostazione più preziosa per il paziente con carico tumorale iniziale non resecabile sarebbe prima dell'inizio di qualsiasi trattamento.

Fino al 50% dei pazienti con carcinoma del colon-retto svilupperà metastasi epatiche sincrone o metacrone in relazione alla rilevazione del tumore primario[2]. Il cardine del trattamento oggi è una combinazione di resezione +/-ablazione delle metastasi, con o senza aumento del volume epatico preoperatorio e chemioterapia talvolta in combinazione con anticorpi[3].

Sono stati identificati numerosi fattori prognostici negativi sia per quanto riguarda la crescita del tumore, sia nel pattern degli oncogeni nei tumori[4]. Tuttavia, uno dei fattori più importanti è la risposta delle metastasi alla chemioterapia sia radiologicamente ma anche nella riduzione dei marcatori tumorali (CEA, CA19/9)[5, 6].

Ancora sappiamo molto poco se le metastasi risponderanno o meno alla terapia somministrata. Il tumore con mutazione KRAS non risponde al trattamento con Erbitux e i tumori mucinosi sono generalmente più resistenti a qualsiasi chemioterapia[7].

Sono stati esplorati diversi modelli per valutare la risposta specifica del tumore al trattamento, ma la maggior parte sono lenti o hanno mostrato risultati contrastanti[8]. Oggi, il modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) del topo è il più utilizzato e convalidato per prevedere la risposta alla terapia, ma la valutazione della terapia oncologica richiede mesi [9]. Pertanto, il modello PDX del topo non può essere utilizzato per il processo decisionale clinico. Le colture di organoidi che utilizzano tumori derivati ​​da pazienti sono uno strumento di screening in vitro ben utilizzato, con risultati promettenti per diversi tumori[10]. Gli organoidi mantengono le caratteristiche genetiche del tessuto tumorale originale. Tuttavia, questi modelli sono lenti quando si tratta di valutare il tessuto dei pazienti per le decisioni terapeutiche e mancano della capacità di valutare i potenziali metastatici o angiogenici.

Recentemente gli embrioni di zebrafish sono stati usati come avatar per il cancro umano, prima nei tumori ematogeni ma ultimamente anche nei tumori solidi come PDAC, cancro al seno e cancro del colon-retto[11-14].

Il modello ha diversi vantaggi, il più forte è la valutazione della risposta solo 3-5 giorni dopo che il tessuto tumorale è stato impiantato negli embrioni. Gli embrioni sono trasparenti in modo che la crescita e la diffusione del tumore possano essere visualizzate in dettaglio e quantificate in modo semiautomatico[15]. Poiché il sistema immunitario degli embrioni di pesce zebra non risponde fino al giorno 8 giorni [14], perché la risposta immunitaria contro il tumore proviene dalle cellule immunitarie del paziente, questo è anche il motivo per cui l'attecchimento dello xenotrapianto funziona in questo modello. D'altro canto. Finora il tessuto bioptico non è sufficiente, ma per generare questi avatar è necessario almeno un centimetro cubo di tessuto tumorale. Per questo motivo, le biopsie con ago non forniscono materiale sufficiente, ma nei protocolli attuali sono necessari tessuti tumorali epatici resecati.

Negli embrioni di pesce zebra, è stato dimostrato che le cellule tumorali del colon-retto crescono e la valutazione della risposta di diverse combinazioni di chemioterapia ha avuto successo con un'ottima correlazione con la risposta nell'uomo[14]. Finora non sono stati eseguiti studi clinici sulle metastasi epatiche del colon-retto.

I pesci sono alloggiati a una temperatura media di 28 °C in un sistema a ricircolo con un ciclo da luce a buio di 14:10 ore. Le uova fecondate di zebrafish sono ottenute dall'accoppiamento naturale del ceppo AB wild-type presso le nostre strutture e gli embrioni in via di sviluppo sono messi in scena in incubatore a 28 °C secondo Kimmel et al[19]. Prima di qualsiasi procedura, gli embrioni saranno anestetizzati in tricaina allo 0,02%. Il tessuto tumorale prelevato dal campione chirurgico dall'istopatologo viene crioconservato immergendo il tessuto in criotubi contenenti mezzo di crioconservazione, aggiungendo i tubi a un criobox e ponendo la scatola in un congelatore a -80 gradi per almeno 24 ore. La provetta con il tessuto viene quindi trasportata su ghiaccio secco al laboratorio del pesce zebra dove il tessuto verrà scongelato, lavato e incubato in una miscela di proteasi all'interno di un dispositivo di disaggregazione meccanica (GentleMACS), per produrre una singola sospensione cellulare dal tessuto. La sospensione viene filtrata e incubata per 30 minuti in 40 μg/mL di CM-Dil in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita da centrifugazione e lavaggio con PBS. Le cellule marcate vengono quindi risospese nel mezzo di impianto e iniettate utilizzando sottili aghi capillari di vetro nel compartimento perivitellino sottocutaneo di embrioni di zebrafish di 2 giorni. Gli embrioni di pesce zebra impiantati con successo vengono quindi trasferiti nel mezzo embrionale contenente i farmaci in esame (ad esempio i farmaci che potrebbero essere presi in considerazione per il trattamento del paziente che dona il campione) e trattati per tre giorni. Le immagini dei tumori vengono acquisite sia immediatamente dopo il trapianto che dopo il periodo di trattamento di tre giorni, e dopo il periodo di trattamento di tre giorni viene acquisita un'immagine aggiuntiva del principale sito metastatico nell'embrione di zebrafish per valutare le capacità metastatiche delle cellule. L'esito del trattamento sarà valutato come variazione del volume del tumore tra il giorno 3 e il giorno 0 nel gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo del veicolo (percentuale) e una riduzione significativamente più forte dei volumi del tumore nel gruppo di trattamento sarà considerata un risultato positivo del trattamento . La prova di un fenotipo pro-metastatico sarà derivata dal numero di cellule trovate nel sito metastatico negli embrioni di zebrafish tre giorni dopo l'impianto. I livelli di cut-off per quante cellule metastatizzate sono necessarie per prevedere la probabile progressione metastatica nel paziente saranno valutati nei primi 10-20 pazienti inclusi poiché tali informazioni non sono attualmente disponibili da altre fonti di informazioni.