Evaluering af tumorvækst og onkologisk behandling hos patienter med CRLM ved hjælp af Zebra Fish Embryo Model (CRLM-Z)

Mulighederne for at forudsige onkologisk tumorrespons for individuelle patienter med GI-maligniteter for at skræddersy en personlig onkologisk behandling, er i øjeblikket begrænsede. Det betyder, at det meste af den information, der bruges til at træffe beslutning om onkologisk behandling, vedrører en gruppe patienter snarere end enkeltpersoner. Tilsvarende er de fleste af de anvendte kemoterapiregimer ikke individuelt skræddersyet, selvom det har vist sig at være gavnligt for visse kohorter af patienter. I kolorektal cancer forudsiger KRAS (Kirsten rottesarkom) og BRAF-mutationsstatus responsen på lægemidler, der er rettet mod forskellige trin i EGFR/KRAS/BRAF-signalvejen, hvorimod MSI/MMR-status kan forudsige resultatet af immuncheckpoint-hæmmere [1]. Da kemoterapi, såvel som andre kræftbehandlinger, kan have alvorlige bivirkninger, kan behandlingen ikke kun være ineffektiv, men kan også forårsage alvorlige bivirkninger, der endda forkorter patientens liv og hæmmer chancen for helbredende tumorresektion. Af denne grund ville evaluering af respons før behandling i en avatarmodel af zebrafisk være mest værdifuld.

Fra et klinisk synspunkt er den letteste situation i adjuverende omgivelser. På dette tidspunkt er hele tumoren tilgængelig til analyse, og større stykker væv kan bruges i avatarmodellen. 5-fluorouracil eller capecitabin (et 5-FU prodrug) enten alene eller i kombination med oxaliplatin er den nuværende standard adjuverende behandling ved stadium III colon cancer og stadium II colon cancer med 2+ risikofaktorer. Andre typer kombinationsregimer inklusive f.eks. irinotecan har hidtil ikke vist gavn i adjuvanssituationen.

I neoadjuverende omgivelser, dvs. præoperativ behandling til patienter med resektabel CRLM, kan kombinationer af 5-FU (eller capecitabin) og enten oxaliplatin eller irinotecan forbedre resultatet af operationen og langtidsprognosen. Det vides på nuværende tidspunkt ikke, hvilket regime der er mest effektivt for den enkelte patient.

I det mest alvorlige scenarie, hvor patienten præsenterer sig med uoperabel CRLM, er enten palliativ kemoterapi eller nedtrapning/konverteringskemoterapi indiceret. For sidstnævnte patientgruppe er det yderst vigtigt at give så potent behandling som muligt i første linie, da de 10.

Det terapeutiske vindue er snævert, og yderligere klinisk og/eller radiologisk progression på førstelinjebehandlingen kan udelukke yderligere onkologiske og kirurgiske indgreb. Fitpatienter kan have gavn af en triplet af 5-FU, oxaliplatin og irinotecan (FOLFOXIRI). Dette er dog et toksisk regime, og ældre eller mindre raske patienter tilbydes mere almindeligt en dublet af 5-FU og enten oxaliplatin eller irinotecan. Der kan være en yderligere værdi, når kemoterapien kombineres med antistoffer rettet mod VEGF eller, for de tumorer, der udtrykker vildtype-KRAS, EGF-receptoren.

Men måske den mest værdifulde indstilling for patienten med på forhånd ikke-operabel tumorbyrde ville være, før nogen behandling er startet.

Op til 50 % af patienter med kolorektal cancer vil udvikle levermetastaser enten synkrone eller metakrone i forhold til påvisning af den primære tumor[2]. Grundpillen i behandlingen i dag er en kombination af resektion +/-ablation af metastaser, med eller uden præoperativ levervolumenforøgelse og kemoterapi nogle gange i kombination med antistoffer[3].

En række negative prognostiske faktorer er blevet identificeret både vedrørende tumorvæksten, men også i mønsteret af onkogener i tumorerne[4]. Alligevel er en af ​​de vigtigste faktorer metastasernes respons på kemoterapi både radiologisk, men også i reduktion af tumormarkører (CEA, CA19/9)[5, 6].

Alligevel har vi meget lidt viden, om metastaserne vil reagere på den givne behandling eller ej. Tumor med KRAS-mutation vil ikke reagere på Erbitux-behandling, og mucinøse tumorer er normalt mere modstandsdygtige over for enhver kemoterapi[7].

Forskellige modeller er blevet undersøgt for at evaluere tumorspecifik respons på behandling, men de fleste er langsomme eller har vist blandede resultater[8]. I dag er musepatientafledt xenograft (PDX) model den mest anvendte og validerede til at forudsige respons på terapi, men evaluering af onkologisk terapi tager måneder [9]. Derfor kan muse-PDX-modellen ikke bruges til klinisk beslutningstagning. Organoide kulturer, der anvender patient-afledte kræftformer, er et velanvendt in vitro-screeningsværktøj med lovende resultater for forskellige tumorer[10]. Organoider opretholder de genetiske karakteristika af det oprindelige tumorvæv. Alligevel er disse modeller langsomme, når det kommer til at evaluere patienters væv til behandlingsbeslutninger og mangler evnen til at evaluere metastatiske eller angiogene potentialer.

For nylig er zebrafiskembryoner blevet brugt som avatarer for human cancer, først i hæmatogene kræftformer, men på det seneste også i solide kræftformer som PDAC, brystkræft og tyktarmskræft[11-14].

Modellen har flere fordele, den stærkeste er responsevaluering kun 3-5 dage efter, at tumorvævet er implanteret i embryoerne. Embryonerne er gennemsigtige, så tumorvækst og spredning kan visualiseres i detaljer og kvantificeres på en semi-automatisk måde[15]. Da zebrafiskembryonernes eget immunsystem først reagerer på dag 8 dage [14], hvorfor immunresponset mod tumoren kommer fra patientens egne immunceller, er dette også grunden til, at xenograft-engraftment virker i denne model. På den anden side. Indtil videre er biopsivæv ikke nok, men der skal mindst en kubikcentimeter tumorvæv til for at generere disse avatarer. Af denne grund giver nålebiopsier ikke nok materiale, men der er behov for resekeret levertumorvæv i de nuværende protokoller.

I zebrafiskembryoner har kolorektale cancerceller vist sig at vokse, og responsevaluering af forskellige kemoterapikombinationer har været vellykket med meget god korrelation til responsen hos mennesker[14]. Kliniske undersøgelser af kolorektale levermetastaser er indtil videre ikke blevet udført.

Fisk opstaldes ved en gennemsnitstemperatur på 28 °C i et recirkulerende system med en 14:10 timers lys til mørk cyklus. Zebrafisk befrugtede æg opnås ved naturlig parring af vildtype AB-stamme på vores faciliteter, og de udviklende embryoner iscenesættes i inkubator ved 28 °C ifølge Kimmel et al.[19]. Før enhver procedure vil embryoner blive bedøvet i 0,02% tricain. Tumorvævet taget fra den kirurgiske prøve af histopatologen kryokonserveres ved at nedsænke vævet i kryorør indeholdende kryokonserveringsmedium, rørene sættes i en kryoboks og anbringe æsken i en -80 graders fryser i mindst 24 timer. Røret med væv transporteres derefter på tøris til zebrafisklaboratoriet, hvor vævet vil blive optøet, vasket og inkuberet i en proteaseblanding i en mekanisk disaggregationsanordning (GentleMACS), for at producere en enkelt cellesuspension fra vævet. Suspensionen filtreres og inkuberes i 30 minutter i 40 μg/ml CM-Dil i phosphatbufret saltvand (PBS), efterfulgt af centrifugering og vask med PBS. De mærkede celler resuspenderes derefter i implantationsmedium og injiceres ved hjælp af tynde glaskapillærnåle i det subkutane perivitelline-rum af 2 dage gamle zebrafiskembryoner. Succesfuldt implanterede zebrafiskembryoner overføres derefter til embryomedium indeholdende de lægemidler, der undersøges (f.eks. de lægemidler, der kunne overvejes til behandling af patienten, der donerer prøven) og behandles i tre dage. Billeder af tumorerne erhverves både umiddelbart efter transplantation og efter den tre-dages behandlingsperiode, og et yderligere billede af det vigtigste metastatiske sted i zebrafiskembryoet erhverves efter den tre-dages behandlingsperiode for at evaluere cellernes metastatiske evner. Behandlingsresultat vil blive evalueret som ændring i tumorvolumen mellem dag 3 og dag 0 i behandlingsgruppen sammenlignet med vehikelkontrolgruppen (procent), og en signifikant stærkere reduktion af tumorvolumen i behandlingsgruppen vil blive betragtet som et positivt behandlingsresultat . Beviser for en pro-metastatisk fænotype vil blive afledt af antallet af celler fundet på det metastatiske sted i zebrafiskembryoner tre dage efter implantation. Afskæringsniveauer for, hvor mange metastaserede celler, der kræves for at forudsige sandsynlig metastatisk progression hos patienten, vil blive evalueret i de første 10-20 inkluderede patienter, da sådan information i øjeblikket ikke er tilgængelig fra andre informationskilder.