Zebra Fish 배아 모델을 이용한 CRLM 환자의 종양 성장 및 종양학적 치료 평가 (CRLM-Z)

개인화된 종양 치료를 맞춤화하기 위해 GI 악성 종양이 있는 개별 환자에 대한 종양 반응을 예측할 수 있는 가능성은 현재 제한적입니다. 이것은 종양 치료를 결정하는 데 사용되는 대부분의 정보가 개인이 아닌 환자 그룹과 관련이 있음을 의미합니다. 유사하게, 사용되는 대부분의 화학 요법 요법은 특정 코호트 환자에게 유익한 것으로 나타났지만 개별적으로 맞춤화되지 않았습니다. 대장암에서 KRAS(Kirsten 쥐 육종) 및 BRAF 돌연변이 상태는 EGFR/KRAS/BRAF 신호 전달 경로의 다양한 단계를 표적으로 하는 약물에 대한 반응을 예측하는 반면, MSI/MMR 상태는 면역 관문 억제제의 결과를 예측할 수 있습니다[1]. 다른 암 치료와 마찬가지로 화학요법은 심각한 부작용을 일으킬 수 있으므로 치료가 효과가 없을 뿐만 아니라 심각한 부작용을 일으켜 환자의 생명을 단축하고 근치적 종양 절제 가능성을 억제할 수도 있습니다. 이러한 이유로 제브라피쉬의 아바타 모델에서 치료 전 반응 평가가 가장 중요할 것입니다.

임상적 관점에서 가장 쉬운 상황은 보조 설정입니다. 이 시점에서 전체 종양을 분석에 사용할 수 있으며 더 큰 조직 조각을 아바타 모델에 사용할 수 있습니다. 5-플루오로우라실 또는 카페시타빈(5-FU 프로드러그) 단독 또는 옥살리플라틴과의 조합은 위험 인자가 2개 이상인 3기 결장암 및 2기 결장암에서 현재 표준 보조 치료법입니다. 예를 들어 다음을 포함하는 다른 유형의 병용 요법. 이리노테칸은 지금까지 아주반트 상황에서 이점을 나타내지 못했습니다.

신보조 설정, 즉 절제 가능한 CRLM 환자에 대한 수술 전 치료에서 5-FU(또는 카페시타빈)와 옥살리플라틴 또는 이리노테칸의 조합은 수술 결과 및 장기 예후를 개선할 수 있습니다. 현재 개별 환자에게 어떤 요법이 가장 효율적인지는 알려져 있지 않습니다.

환자가 절제 불가능한 CRLM을 나타내는 가장 심각한 시나리오에서는 완화 화학요법 또는 축소/전환 화학요법이 지시됩니다. 후자의 환자 그룹의 경우 첫 번째 라인에서 가능한 한 강력한 치료를 제공하는 것이 가장 중요합니다.

치료 범위가 좁고 1차 치료에서 추가 임상 및/또는 방사선학적 진행이 추가 종양학적 및 외과적 중재를 배제할 수 있습니다. 건강한 환자는 5-FU, 옥살리플라틴 및 이리노테칸(FOLFOXIRI)의 삼중항으로부터 혜택을 받을 수 있습니다. 그러나 이것은 독성 요법이며 나이가 많거나 건강이 좋지 않은 환자에게는 5-FU와 옥살리플라틴 또는 이리노테칸의 이중 요법이 더 일반적으로 제공됩니다. 화학 요법이 VEGF를 표적으로 하는 항체 또는 야생형 KRAS를 발현하는 종양의 경우 EGF 수용체와 결합될 때 추가 가치가 있을 수 있습니다.

그러나 절제 불가능한 선행 종양 부하가 있는 환자에게 가장 가치 있는 설정은 치료가 시작되기 전일 것입니다.

대장암 환자의 최대 50%는 원발성 종양의 발견과 관련하여 동시성 또는 이시성 간 전이로 발전합니다[2]. 오늘날 치료의 중심은 절제 +/- 전이 제거, 수술 전 간 부피 증가 여부 및 때때로 항체와 함께 화학 요법의 조합입니다[3].

다수의 부정적인 예후 인자가 종양 성장뿐만 아니라 종양의 발암원 패턴에서도 확인되었습니다[4]. 그럼에도 불구하고 가장 중요한 요인 중 하나는 화학요법에 대한 전이의 반응이 방사선학적으로 뿐만 아니라 종양 표지자의 감소에서도 나타납니다(CEA, CA19/9)[5, 6].

여전히 전이가 주어진 치료에 반응할지 여부에 대한 지식이 거의 없습니다. KRAS 돌연변이가 있는 종양은 얼비툭스 치료에 반응하지 않으며, 점액성 종양은 일반적으로 어떤 화학요법에도 내성이 더 강합니다[7].

치료에 대한 종양 특이적 반응을 평가하기 위해 다양한 모델이 탐색되었지만 대부분은 느리거나 혼합된 결과를 보였습니다[8]. 오늘날 마우스 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 치료에 대한 반응을 예측하는 데 가장 많이 사용되고 검증되었지만 종양 치료의 평가에는 몇 개월이 걸립니다[9]. 따라서 마우스 PDX 모델은 임상 의사 결정에 사용할 수 없습니다. 환자 유래 암을 사용하는 오가노이드 배양은 잘 사용되는 시험관 내 스크리닝 도구이며, 다양한 종양에 대한 유망한 결과가 있습니다[10]. 오가노이드는 원래 종양 조직의 유전적 특성을 유지합니다. 그러나 이러한 모델은 치료 결정을 위해 환자의 조직을 평가할 때 느리고 전이성 또는 혈관신생 가능성을 평가하는 능력이 부족합니다.

최근에 제브라피쉬 배아는 인간 암에 대한 아바타로 사용되었는데, 처음에는 혈종암에서, 최근에는 PDAC, 유방암 및 결장직장암과 같은 고형암에서도 사용되었습니다[11-14].

모델에는 몇 가지 장점이 있으며 가장 강력한 것은 종양 조직이 배아에 이식된 후 3-5일 만에 반응 평가입니다. 배아는 투명하여 종양의 성장과 전이를 자세히 시각화하고 반자동 방식으로 정량화할 수 있습니다[15]. 제브라 피쉬 배아 자체 면역 체계가 8일까지 반응하지 않기 때문에[14] 종양에 대한 면역 반응이 환자 자신의 면역 세포에서 나오는 이유도 이 모델에서 이종이식 생착이 작동하는 이유입니다. 반면에. 지금까지 생검 조직으로는 충분하지 않지만 이러한 아바타를 생성하려면 최소한 1세제곱센티미터의 종양 조직이 필요합니다. 이러한 이유로 바늘 생검은 충분한 물질을 제공하지 못하지만 현재 프로토콜에서는 절제된 간 종양 조직이 필요합니다.

제브라피시 배아에서 결장직장암 세포가 성장하는 것으로 나타났으며 다양한 화학요법 조합의 반응 평가가 인간의 반응과 매우 좋은 상관관계를 보이며 성공적이었습니다[14]. 결장 직장 간 전이에 대한 임상 연구는 아직 수행되지 않았습니다.

물고기는 14시 10분의 빛에서 어두운 주기로 재순환 시스템에서 28°C의 평균 온도에 보관됩니다. Zebrafish 수정란은 우리 시설에서 야생형 AB 균주의 자연 교배에 의해 얻어지며 발달 중인 배아는 Kimmel et al[19]에 따라 28°C의 인큐베이터에 보관됩니다. 모든 시술 전에 배아는 0.02% 트리카인으로 마취됩니다. 조직병리학자가 수술 표본에서 채취한 종양 조직은 조직을 냉동보존 배지가 들어 있는 냉동튜브에 담그고 튜브를 냉동상자에 추가한 다음 상자를 -80도 냉동고에 최소 24시간 동안 넣어 냉동보존합니다. 그런 다음 조직이 있는 튜브를 드라이아이스로 제브라피시 실험실로 운반하여 조직을 해동, 세척하고 기계적 분해 장치(GentleMACS) 내의 프로테아제 혼합물에서 배양하여 조직에서 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 현탁액을 여과하고 인산염 완충 식염수(PBS) 중 40㎍/mL CM-Dil에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 원심분리하고 PBS로 세척합니다. 표지된 세포는 이식 배지에 다시 현탁되고 얇은 유리 모세관 바늘을 사용하여 2일 된 제브라피시 배아의 피하 perivitelline 구획에 주입됩니다. 성공적으로 이식된 제브라피쉬 배아는 조사 중인 약물(예: 샘플을 기증한 환자의 치료를 위해 고려할 수 있는 약물)이 포함된 배아 배지로 옮겨져 3일 동안 치료됩니다. 종양의 이미지는 이식 직후와 3일의 치료 기간 후에 모두 취득하고, 세포의 전이 능력을 평가하기 위해 3일의 치료 기간 후에 제브라피쉬 배아의 주요 전이 부위의 추가 이미지를 취득합니다. 치료 결과는 비히클 대조군(백분율)과 비교하여 치료군에서 3일과 0일 사이의 종양 부피의 변화로 평가되며, 치료군에서 훨씬 더 강력한 종양 부피 감소는 긍정적인 치료 결과로 간주됩니다. . 전이성 표현형의 증거는 이식 3일 후 제브라피시 배아의 전이 부위에서 발견되는 세포 수에서 파생됩니다. 환자의 전이 진행 가능성을 예측하는 데 얼마나 많은 전이 세포가 필요한지에 대한 컷오프 수준은 포함된 처음 10-20명의 환자에서 평가될 것입니다. 그러한 정보는 현재 다른 정보 출처에서 사용할 수 없기 때문입니다.