Оценка роста опухоли и онкологического лечения у пациентов с CRLM с использованием модели эмбриона рыбки-зебры (CRLM-Z)

Возможности прогнозирования реакции онкологической опухоли у отдельных пациентов со злокачественными новообразованиями ЖКТ с целью подбора индивидуального онкологического лечения в настоящее время ограничены. Это означает, что большая часть информации, используемой для принятия решения об онкологическом лечении, относится к группе пациентов, а не к отдельным лицам. Точно так же большинство используемых схем химиотерапии не подбираются индивидуально, хотя было показано, что они полезны для определенных групп пациентов. При колоректальном раке KRAS (саркома крысы Кирстена) и мутационный статус BRAF предсказывают реакцию на лекарства, нацеленные на различные этапы сигнального пути EGFR/KRAS/BRAF, тогда как статус MSI/MMR может предсказывать исход ингибиторов иммунных контрольных точек [1]. Поскольку химиотерапия, как и другие методы лечения рака, может иметь серьезные побочные эффекты, лечение может быть не только неэффективным, но также может вызывать серьезные побочные эффекты, даже сокращая жизнь пациента и препятствуя возможности радикальной резекции опухоли. По этой причине оценка реакции до лечения в модели аватара рыбки данио была бы наиболее ценной.

С клинической точки зрения наиболее легкая ситуация возникает при адъювантной терапии. На этом этапе вся опухоль доступна для анализа, и в модели аватара можно использовать более крупные фрагменты тканей. 5-фторурацил или капецитабин (пролекарство 5-ФУ) отдельно или в комбинации с оксалиплатином в настоящее время являются стандартом адъювантной терапии при раке толстой кишки стадии III и стадии рака толстой кишки II с 2+ факторами риска. Другие типы комбинированных схем, включая, например, иринотекан до сих пор не продемонстрировал преимуществ в адъювантной терапии.

В неоадъювантной терапии, то есть при предоперационном лечении пациентов с резектабельным CRLM, комбинации 5-ФУ (или капецитабина) и либо оксалиплатина, либо иринотекана могут улучшить исход операции и долгосрочный прогноз. В настоящее время неизвестно, какой режим наиболее эффективен для конкретного пациента.

В наиболее тяжелом сценарии, когда у пациента имеется нерезектабельный CRLM, показана либо паллиативная химиотерапия, либо химиотерапия для уменьшения/конверсии. Для последней группы пациентов крайне важно обеспечить как можно более мощное лечение в первой линии, как и в первой линии.

Терапевтическое окно является узким, и дальнейшее клиническое и/или рентгенологическое прогрессирование терапии первой линии может исключить дальнейшие онкологические и хирургические вмешательства. Пациентам в хорошей физической форме может помочь триплет из 5-фторурацила, оксалиплатина и иринотекана (FOLFOXIRI). Тем не менее, это токсический режим, и пожилым или менее здоровым пациентам чаще предлагают дублет 5-ФУ и либо оксалиплатин, либо иринотекан. Может быть дополнительная ценность, когда химиотерапия сочетается с антителами, нацеленными на VEGF или, для тех опухолей, которые экспрессируют KRAS дикого типа, на рецептор EGF.

Но, возможно, самое ценное состояние для пациента с нерезектабельной опухолевой массой было бы до начала какого-либо лечения.

До 50% пациентов с колоректальным раком будут иметь метастазы в печени, синхронные или метахронные по отношению к обнаружению первичной опухоли [2]. Основой лечения сегодня является комбинация резекции +/-абляция метастазов с предоперационным увеличением объема печени или без него и химиотерапией, иногда в сочетании с антителами [3].

Выявлен ряд негативных прогностических факторов как в отношении роста опухоли, так и в структуре онкогенов в опухолях [4]. Тем не менее, одним из наиболее важных факторов является ответ метастазов на химиотерапию как по рентгенологическим данным, так и по снижению онкомаркеров (CEA, CA19/9) [5, 6].

Тем не менее у нас очень мало знаний о том, будут ли метастазы реагировать на проводимую терапию или нет. Опухоли с мутацией KRAS не реагируют на лечение Эрбитуксом, а муцинозные опухоли обычно более устойчивы к любой химиотерапии [7].

Были изучены различные модели для оценки специфического ответа опухоли на лечение, но большинство из них работают медленно или дают неоднозначные результаты [8]. Сегодня модель ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX), является наиболее используемой и проверенной для прогнозирования ответа на терапию, но оценка онкологической терапии занимает месяцы [9]. Таким образом, модель мыши PDX не может быть использована для принятия клинических решений. Органоидные культуры с использованием раковых образований, полученных от пациентов, являются хорошо используемым инструментом скрининга in vitro с многообещающими результатами для различных опухолей [10]. Органоиды сохраняют генетические характеристики исходной опухолевой ткани. Тем не менее, эти модели медленны, когда дело доходит до оценки тканей пациентов для принятия решения о лечении, и им не хватает способности оценивать метастатический или ангиогенный потенциалы.

Недавно эмбрионы рыбок данио использовались в качестве аватаров для рака человека, сначала при гематогенном раке, а в последнее время также при солидных раках, таких как PDAC, рак молочной железы и колоректальный рак [11-14].

Модель имеет ряд преимуществ, самым сильным является оценка ответа уже через 3-5 дней после имплантации опухолевой ткани в эмбрионы. Эмбрионы прозрачны, поэтому рост и распространение опухоли можно детально визуализировать и количественно оценить в полуавтоматическом режиме[15]. Поскольку собственная иммунная система эмбрионов рыбок данио не реагирует до 8-го дня [14], поэтому иммунный ответ против опухоли исходит от собственных иммунных клеток пациента, это также является причиной того, что приживление ксенотрансплантата работает в этой модели. С другой стороны. Пока биопсийной ткани недостаточно, но для создания этих аватаров нужен хотя бы кубический сантиметр опухолевой ткани. По этой причине пункционная биопсия не дает достаточного количества материала, но в текущих протоколах необходимы резецированные ткани опухоли печени.

Было показано, что у эмбрионов рыбок данио клетки колоректального рака растут, и оценка ответа на различные комбинации химиотерапии была успешной с очень хорошей корреляцией с ответом у людей [14]. Клинические исследования метастазов колоректального рака в печень до сих пор не проводились.

Рыбу содержат при средней температуре 28 °C в рециркуляционной системе с циклом от света до темноты 14:10. Оплодотворенная икра рыбок данио получается путем естественного спаривания штамма AB дикого типа на наших объектах, а развивающиеся эмбрионы помещаются в инкубатор при 28 °C в соответствии с Kimmel et al [19]. Перед любой процедурой эмбрионы анестезируют 0,02% раствором трикаина. Опухолевая ткань, взятая гистопатологом из операционного образца, подвергается криоконсервации путем погружения ткани в криопробирки, содержащие среду для криоконсервации, добавления пробирок в криобокс и помещения бокса в морозильную камеру при температуре -80 градусов не менее чем на 24 часа. Затем пробирку с тканью транспортируют на сухом льду в лабораторию для рыбок данио, где ткань размораживают, промывают и инкубируют в смеси протеаз в устройстве для механической дезагрегации (GentleMACS) для получения суспензии отдельных клеток из ткани. Суспензию фильтруют и инкубируют в течение 30 мин в 40 мкг/мл CM-Dil в фосфатно-солевом буфере (PBS) с последующим центрифугированием и промывкой PBS. Затем меченые клетки ресуспендируют в имплантационной среде и вводят с помощью тонких стеклянных капиллярных игл в подкожный перивителлиновый компартмент 2-дневных эмбрионов рыбок данио. Затем успешно имплантированные эмбрионы рыбок данио переносят в среду для зародышей, содержащую исследуемые препараты (например, препараты, которые можно рассматривать для лечения пациента, сдавшего образец), и обрабатывают в течение трех дней. Изображения опухолей получают как сразу после трансплантации, так и после трехдневного периода лечения, а дополнительное изображение основного места метастазирования в эмбрионе рыбок данио получают после трехдневного периода лечения для оценки метастатических возможностей клеток. Результат лечения будет оцениваться как изменение объема опухоли между 3-м и 0-м днем ​​в группе лечения по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (в процентах), и значительно более сильное уменьшение объемов опухоли в группе лечения будет рассматриваться как положительный результат лечения. . Доказательства прометастатического фенотипа будут получены из числа клеток, обнаруженных в месте метастазирования у эмбрионов рыбок данио через три дня после имплантации. Пороговые уровни того, сколько метастазирующих клеток требуется для прогнозирования вероятного метастатического прогрессирования у пациента, будут оцениваться у первых 10-20 включенных пациентов, поскольку такая информация в настоящее время недоступна из других источников информации.