Avaliação do crescimento tumoral e tratamento oncológico em pacientes com CRLM usando modelo de embrião de peixe zebra (CRLM-Z)

As possibilidades de prever a resposta tumoral oncológica para pacientes individuais com malignidades gastrointestinais, a fim de adaptar um tratamento oncológico personalizado, são atualmente limitadas. Isso significa que a maioria das informações usadas para decidir sobre o tratamento oncológico pertence a um grupo de pacientes e não a indivíduos. Da mesma forma, a maioria dos regimes quimioterápicos utilizados não é individualizada, embora tenha se mostrado benéfico para certos grupos de pacientes. No câncer colorretal, o estado de mutação KRAS (sarcoma do rato Kirsten) e BRAF predizem a resposta a medicamentos direcionados a várias etapas na via de sinalização EGFR/KRAS/BRAF, enquanto o estado MSI/MMR pode prever o resultado de inibidores do ponto de checagem imunológico [1]. Como a quimioterapia, assim como outros tratamentos contra o câncer, pode ter efeitos colaterais graves, o tratamento pode não apenas ser ineficaz, mas também causar eventos adversos graves, encurtando a vida do paciente e inibindo a chance de ressecção curativa do tumor. Por esta razão, a avaliação da resposta pré-tratamento em um modelo avatar de peixe-zebra seria mais valiosa.

Do ponto de vista clínico, a situação mais fácil é no cenário adjuvante. Neste ponto, todo o tumor está disponível para análise e pedaços maiores de tecidos podem ser usados ​​no modelo de avatar. 5-fluorouracil ou capecitabina (um pró-fármaco 5-FU) isoladamente ou em combinação com oxaliplatina é o tratamento adjuvante padrão atual no câncer de cólon em estágio III e câncer de cólon em estágio II com 2+ fatores de risco. Outros tipos de regimes de combinação incluindo, e. O irinotecano até agora não demonstrou benefício na situação adjuvante.

No cenário neoadjuvante, ou seja, tratamento pré-operatório para pacientes com CRLM ressecável, combinações de 5-FU (ou capecitabina) e oxaliplatina ou irinotecano podem melhorar o resultado da cirurgia e o prognóstico a longo prazo. Atualmente, não se sabe qual regime é mais eficiente para o paciente individual.

No cenário mais grave, em que o paciente apresenta CRLM irressecável, é indicada quimioterapia paliativa ou quimioterapia de redução/conversão. Para o último grupo de pacientes, é de extrema importância fornecer o tratamento mais potente possível na primeira linha, como o 10

A janela terapêutica é estreita e a progressão clínica e/ou radiológica adicional na terapia de primeira linha pode impedir outras intervenções oncológicas e cirúrgicas. Pacientes aptos podem se beneficiar de um trigêmeo de 5-FU, oxaliplatina e irinotecano (FOLFOXIRI). No entanto, este é um regime tóxico, e os pacientes mais velhos ou menos aptos recebem mais comumente um dupleto de 5-FU e oxaliplatina ou irinotecano. Pode haver um valor adicional quando a quimioterapia é combinada com anticorpos direcionados ao VEGF ou, para aqueles tumores que expressam KRAS do tipo selvagem, o receptor EGF.

Mas talvez o cenário mais valioso para o paciente com carga tumoral inicial não ressecável seja antes do início de qualquer tratamento.

Até 50% dos pacientes com câncer colorretal desenvolverão metástases hepáticas sincrônicas ou metacrônicas em relação à detecção do tumor primário [2]. A base do tratamento hoje é uma combinação de ressecção +/-ablação de metástases, com ou sem aumento do volume hepático pré-operatório e quimioterapia, às vezes em combinação com anticorpos [3].

Vários fatores prognósticos negativos foram identificados em relação ao crescimento do tumor, mas também no padrão de oncogênicos nos tumores [4]. Ainda assim, um dos fatores mais importantes é a resposta das metástases à quimioterapia tanto radiologicamente como também na redução dos marcadores tumorais (CEA, CA19/9)[5,6].

Ainda temos muito pouco conhecimento se as metástases vão responder à terapia dada ou não. O tumor com mutação KRAS não responderá ao tratamento com Erbitux, e os tumores mucinosos são geralmente mais resistentes a qualquer quimioterapia [7].

Diferentes modelos foram explorados para avaliar a resposta específica do tumor ao tratamento, mas a maioria é lenta ou mostrou resultados mistos [8]. Hoje, o modelo de xenoenxerto derivado de paciente de camundongo (PDX) é o mais usado e validado para prever a resposta à terapia, mas a avaliação da terapia oncológica leva meses [9]. Portanto, o modelo de mouse PDX não pode ser usado para tomada de decisão clínica. Culturas de organoides usando cânceres derivados de pacientes são uma ferramenta de triagem in vitro bem utilizada, com resultados promissores para diferentes tumores [10]. Os organoides mantêm as características genéticas do tecido tumoral original. Ainda assim, esses modelos são lentos quando se trata de avaliar o tecido dos pacientes para decisões de tratamento e carecem da capacidade de avaliar potenciais metastáticos ou angiogênicos.

Recentemente, embriões de zebrafish foram usados ​​como avatares para câncer humano, primeiro em cânceres hematogênicos, mas ultimamente também em cânceres sólidos como PDAC, câncer de mama e câncer colorretal [11-14].

O modelo tem várias vantagens, a mais forte é a avaliação da resposta apenas 3-5 dias após o tecido tumoral ser implantado nos embriões. Os embriões são transparentes, de modo que o crescimento e a disseminação do tumor podem ser visualizados em detalhes e quantificados de maneira semiautomática [15]. Como o próprio sistema imunológico dos embriões de peixe-zebra não responde até o dia 8 dias [14], porque a resposta imune contra o tumor vem das próprias células imunes do paciente, esta também é a razão pela qual o enxerto de xenoenxerto funciona neste modelo. Por outro lado. Até agora, o tecido da biópsia não é suficiente, mas pelo menos um centímetro cúbico de tecido tumoral é necessário para gerar esses avatares. Por esta razão, as biópsias de agulha não estão fornecendo material suficiente, mas os tecidos tumorais hepáticos ressecados são necessários nos protocolos atuais.

Em embriões de peixe-zebra, foi demonstrado que as células de câncer colorretal crescem e a avaliação da resposta de diferentes combinações de quimioterapia foi bem-sucedida com uma correlação muito boa com a resposta em humanos [14]. Até o momento, não foram realizados estudos clínicos sobre metástases hepáticas colorretais.

Os peixes são alojados a uma temperatura média de 28 °C em um sistema de recirculação com um ciclo claro-escuro de 14:10 h. Ovos fertilizados de peixe-zebra são obtidos por acasalamento natural da cepa AB selvagem em nossas instalações e os embriões em desenvolvimento são colocados em incubadora a 28 °C de acordo com Kimmel et al [19]. Antes de qualquer procedimento, os embriões serão anestesiados em tricaína a 0,02%. O tecido tumoral retirado da peça cirúrgica pelo histopatologista é criopreservado submergindo o tecido em criotubos contendo meio de criopreservação, adicionando os tubos a uma criobox e colocando a caixa em um freezer a -80 graus por pelo menos 24 horas. O tubo com o tecido é então transportado em gelo seco para o laboratório zebrafish onde o tecido será descongelado, lavado e incubado em uma mistura de protease dentro de um dispositivo de desagregação mecânica (GentleMACS), para produzir uma única suspensão celular do tecido. A suspensão é filtrada e incubada por 30 min em 40 μg/mL CM-Dil em solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguida de centrifugação e lavagem com PBS. As células marcadas são então ressuspensas em meio de implantação e injetadas usando agulhas capilares de vidro finas no compartimento perivitelino subcutâneo de embriões de peixe-zebra de 2 dias de idade. Os embriões de peixe-zebra implantados com sucesso são então transferidos para meio de embrião contendo as drogas sob investigação (por exemplo, as drogas que podem ser consideradas para o tratamento do paciente doador da amostra) e tratados por três dias. As imagens dos tumores são adquiridas imediatamente após o transplante e após o período de tratamento de três dias, e uma imagem adicional do principal local metastático no embrião do peixe-zebra é adquirida após o período de tratamento de três dias para avaliar as capacidades metastáticas das células. O resultado do tratamento será avaliado como alteração no volume do tumor entre o dia 3 e o dia 0 no grupo de tratamento em comparação com o grupo de controle do veículo (porcentagem), e uma redução significativamente mais forte dos volumes do tumor no grupo de tratamento será considerada como um resultado positivo do tratamento . A evidência de um fenótipo pró-metastático será derivada do número de células encontradas no local metastático nos embriões de peixe-zebra três dias após a implantação. Os níveis de corte para quantas células metastáticas são necessárias para prever a provável progressão metastática no paciente serão avaliados nos primeiros 10 a 20 pacientes incluídos, pois essa informação não está disponível atualmente em outras fontes de informação.