Ocena wzrostu guza i leczenia onkologicznego u pacjentów z CRLM przy użyciu modelu zarodka danio pręgowanego (CRLM-Z)

Możliwości przewidywania odpowiedzi nowotworu onkologicznego u poszczególnych pacjentów z nowotworami przewodu pokarmowego w celu dopasowania spersonalizowanego leczenia onkologicznego są obecnie ograniczone. Oznacza to, że większość informacji wykorzystywanych przy podejmowaniu decyzji o leczeniu onkologicznym dotyczy raczej grupy pacjentów niż jednostek. Podobnie, większość stosowanych schematów chemioterapii nie jest dostosowana indywidualnie, chociaż wykazano, że jest korzystna dla niektórych kohort pacjentów. W raku jelita grubego status mutacji KRAS (mięsak szczura Kirsten) i BRAF jest predyktorem odpowiedzi na leki ukierunkowane na różne etapy szlaku sygnałowego EGFR/KRAS/BRAF, podczas gdy status MSI/MMR może przewidywać wynik stosowania inhibitorów immunologicznego punktu kontrolnego [1]. Ponieważ chemioterapia, podobnie jak inne terapie przeciwnowotworowe, może wiązać się z poważnymi skutkami ubocznymi, leczenie może być nie tylko nieskuteczne, ale może również powodować poważne zdarzenia niepożądane, nawet skracające życie pacjenta i hamujące szanse na wyleczenie guza. Z tego powodu ocena odpowiedzi przed leczeniem w modelu awatara danio pręgowanego byłaby najbardziej wartościowa.

Z klinicznego punktu widzenia najłatwiejsza sytuacja występuje w leczeniu adjuwantowym. W tym momencie do analizy dostępny jest cały guz, aw modelu awatara można użyć większych fragmentów tkanek. 5-fluorouracyl lub kapecytabina (prolek 5-FU) sam lub w połączeniu z oksaliplatyną jest obecnie standardowym leczeniem uzupełniającym w raku okrężnicy w stadium III i raku okrężnicy w stadium II z 2+ czynnikami ryzyka. Inne typy schematów skojarzonych, w tym np. jak dotąd irynotekan nie wykazał korzyści w przypadku stosowania adiuwantu.

W leczeniu neoadjuwantowym, tj. leczeniu przedoperacyjnym pacjentów z resekcyjnym CRLM, połączenie 5-FU (lub kapecytabiny) i oksaliplatyny lub irynotekanu może poprawić wynik operacji i rokowanie długoterminowe. Obecnie nie wiadomo, który schemat jest najskuteczniejszy dla danego pacjenta.

W najpoważniejszym scenariuszu, gdy u pacjenta występuje nieoperacyjny CRLM, wskazana jest chemioterapia paliatywna lub chemioterapia zmniejszająca/konwersyjna. Dla tej ostatniej grupy pacjentów niezwykle ważne jest zapewnienie możliwie silnego leczenia w pierwszej linii, ponieważ 10

Okno terapeutyczne jest wąskie, a dalsza progresja kliniczna i/lub radiologiczna w leczeniu pierwszego rzutu może wykluczać dalsze interwencje onkologiczne i chirurgiczne. Sprawni pacjenci mogą odnieść korzyści z potrójnej dawki 5-FU, oksaliplatyny i irynotekanu (FOLFOXIRI). Jest to jednak schemat toksyczny, a starszym lub mniej sprawnym pacjentom częściej proponuje się dublet 5-FU i oksaliplatyny lub irynotekanu. Dodatkową wartość może mieć połączenie chemioterapii z przeciwciałami ukierunkowanymi na VEGF lub, w przypadku guzów wykazujących ekspresję KRAS typu dzikiego, receptor EGF.

Ale być może najcenniejszym ustawieniem dla pacjenta z początkowym obciążeniem nieoperacyjnym guzem byłoby przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia.

Nawet u 50% pacjentów z rakiem jelita grubego rozwiną się przerzuty do wątroby synchroniczne lub metachroniczne w zależności od wykrycia guza pierwotnego[2]. Podstawą współczesnego leczenia jest połączenie resekcji +/- ablacji przerzutów, z przedoperacyjnym zwiększeniem objętości wątroby lub bez niej oraz chemioterapią, czasami w połączeniu z przeciwciałami [3].

Zidentyfikowano szereg negatywnych czynników prognostycznych zarówno dotyczących wzrostu guza, jak i rozmieszczenia onkogenów w guzach [4]. Nadal jednym z najważniejszych czynników jest odpowiedź przerzutów na chemioterapię, zarówno radiologiczna, jak i redukcja markerów nowotworowych (CEA, CA19/9) [5, 6].

Nadal mamy bardzo małą wiedzę, czy przerzuty zareagują na zastosowaną terapię, czy nie. Guz z mutacją KRAS nie będzie reagował na leczenie Erbituxem, a guzy śluzowe są zwykle bardziej oporne na jakąkolwiek chemioterapię [7].

Zbadano różne modele w celu oceny specyficznej odpowiedzi guza na leczenie, ale większość z nich jest powolna lub daje mieszane wyniki [8]. Obecnie najczęściej stosowanym i sprawdzonym modelem przewidywania odpowiedzi na terapię jest ksenoprzeszczep pochodzący od myszy (PDX), ale ocena terapii onkologicznej zajmuje miesiące [9]. Dlatego mysi model PDX nie może być używany do podejmowania decyzji klinicznych. Hodowle organoidów wykorzystujące nowotwory pochodzące od pacjentów są dobrze stosowanym narzędziem przesiewowym in vitro, z obiecującymi wynikami dla różnych nowotworów[10]. Organoidy zachowują cechy genetyczne pierwotnej tkanki nowotworowej. Mimo to modele te są powolne, jeśli chodzi o ocenę tkanek pacjentów pod kątem decyzji terapeutycznych i nie mają możliwości oceny potencjału przerzutowego lub angiogennego.

Ostatnio zarodki danio pręgowanego były używane jako awatary w leczeniu raka u ludzi, najpierw w nowotworach krwiopochodnych, ale ostatnio także w nowotworach litych, takich jak PDAC, rak piersi i rak jelita grubego [11-14].

Model ma kilka zalet, z których najsilniejszą jest ocena odpowiedzi już po 3-5 dniach od implantacji tkanki nowotworowej do zarodków. Zarodki są przezroczyste, więc wzrost i rozprzestrzenianie się guza można szczegółowo zwizualizować i określić ilościowo w sposób półautomatyczny[15]. Ponieważ własny układ odpornościowy zarodków danio pręgowanego nie odpowiada do 8 dnia [14], dlaczego odpowiedź immunologiczna przeciwko nowotworowi pochodzi z własnych komórek odpornościowych pacjenta, jest to również powód, dla którego wszczepienie ksenoprzeszczepu działa w tym modelu. Z drugiej strony. Jak dotąd tkanka z biopsji nie wystarczy, ale do wygenerowania tych awatarów potrzebny jest co najmniej centymetr sześcienny tkanki nowotworowej. Z tego powodu biopsje igłowe nie dostarczają wystarczającej ilości materiału, ale w obecnych protokołach potrzebne są wycięte tkanki guza wątroby.

Wykazano, że w zarodkach danio pręgowanego komórki raka jelita grubego rosną, a ocena odpowiedzi na różne kombinacje chemioterapii zakończyła się sukcesem, z bardzo dobrą korelacją z odpowiedzią u ludzi[14]. Dotychczas nie przeprowadzono badań klinicznych nad przerzutami do wątroby jelita grubego.

Ryby trzyma się w średniej temperaturze 28 °C w systemie recyrkulacyjnym z cyklem od światła do ciemności 14:10 h. Zapłodnione jaja danio pręgowanego uzyskuje się w wyniku naturalnego krycia szczepu AB typu dzikiego w naszych obiektach, a rozwijające się zarodki umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 28°C według Kimmela i wsp. [19]. Przed jakimkolwiek zabiegiem zarodki zostaną znieczulone w 0,02% trikainie. Tkankę guza pobraną z materiału chirurgicznego przez histopatologa poddaje się kriokonserwacji poprzez zanurzenie tkanki w krioprobówkach zawierających pożywkę kriokonserwacyjną, umieszczenie probówek w pojemniku kriogenicznym i umieszczenie pojemnika w zamrażarce w temperaturze -80 stopni na co najmniej 24 godziny. Probówka z tkanką jest następnie transportowana na suchym lodzie do laboratorium danio pręgowanego, gdzie tkanka zostanie rozmrożona, przemyta i inkubowana w mieszaninie proteaz w urządzeniu do mechanicznej dezagregacji (GentleMACS), aby wytworzyć z tkanki zawiesinę pojedynczych komórek. Zawiesinę filtruje się i inkubuje przez 30 minut w 40 μg/ml CM-Dil w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie odwirowuje i przemywa PBS. Wyznakowane komórki są następnie ponownie zawieszane w pożywce do implantacji i wstrzykiwane za pomocą cienkich szklanych igieł kapilarnych do podskórnego przedziału okołowitellinowego 2-dniowych zarodków danio pręgowanego. Pomyślnie wszczepione zarodki danio pręgowanego są następnie przenoszone do pożywki dla zarodków zawierającej badane leki (np. leki, które można rozważyć w leczeniu pacjenta będącego dawcą próbki) i leczone przez trzy dni. Obrazy guzów uzyskuje się zarówno bezpośrednio po przeszczepie, jak i po trzydniowym okresie leczenia, a dodatkowy obraz głównego miejsca przerzutu w zarodku danio pręgowanego uzyskuje się po trzydniowym okresie leczenia w celu oceny zdolności komórek do tworzenia przerzutów. Wynik leczenia zostanie oceniony jako zmiana objętości guza między dniem 3 a dniem 0 w grupie leczonej w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą nośnik (w procentach), a znacznie silniejsze zmniejszenie objętości guza w grupie leczonej zostanie uznane za pozytywny wynik leczenia . Dowód na fenotyp sprzyjający przerzutom zostanie uzyskany na podstawie liczby komórek znalezionych w miejscu przerzutu w zarodkach danio pręgowanego trzy dni po implantacji. Poziomy odcięcia dla liczby komórek z przerzutami potrzebnych do przewidzenia prawdopodobnej progresji przerzutów u pacjenta zostaną ocenione u pierwszych 10-20 włączonych pacjentów, ponieważ takie informacje nie są obecnie dostępne z innych źródeł informacji.