Hodnocení nádorového růstu a onkologické léčby u pacientů s CRLM pomocí modelu embryí ryb zebry (CRLM-Z)

Možnosti predikce onkologické nádorové odpovědi u jednotlivých pacientů s GI malignitami za účelem přizpůsobení personalizované onkologické léčby jsou v současnosti omezené. To znamená, že většina informací používaných k rozhodování o onkologické léčbě se týká spíše skupiny pacientů než jednotlivců. Podobně většina používaných chemoterapeutických režimů není individuálně přizpůsobena, ačkoli se ukázalo, že je prospěšná pro určité skupiny pacientů. U kolorektálního karcinomu predikují stav KRAS (Kirsten rat sarcoma) a mutační stav BRAF odpověď na léky zacílené na různé kroky signální dráhy EGFR/KRAS/BRAF, zatímco stav MSI/MMR může předpovídat výsledek podávání inhibitorů imunitního kontrolního bodu [1]. Vzhledem k tomu, že chemoterapie, stejně jako jiná léčba rakoviny, může mít závažné vedlejší účinky, může být léčba nejen neúčinná, ale může také způsobit závažné nežádoucí příhody, které dokonce zkrátí život pacienta a zabrání možnosti kurativní resekce nádoru. Z tohoto důvodu by bylo nejcennější hodnocení odezvy před léčbou v avatarském modelu zebřičky.

Z klinického hlediska je nejjednodušší situace v adjuvantní léčbě. V tomto okamžiku je celý nádor k dispozici pro analýzu a větší kusy tkání mohou být použity v modelu avatara. 5-fluorouracil nebo kapecitabin (proléčivo 5-FU), buď samostatně, nebo v kombinaci s oxaliplatinou, jsou současnou standardní adjuvantní léčbou u karcinomu tlustého střeva stadia III a karcinomu tlustého střeva stadia II s rizikovými faktory 2+. Jiné typy kombinačních režimů včetně např. irinotecan zatím neprokázal přínos v adjuvantní situaci.

V neoadjuvantní léčbě, tj. předoperační léčbě pacientů s resekabilním CRLM, mohou kombinace 5-FU (nebo kapecitabinu) a buď oxaliplatiny nebo irinotekanu zlepšit výsledek operace a dlouhodobou prognózu. V současné době není známo, který režim je pro jednotlivého pacienta nejúčinnější.

V nejzávažnějším scénáři, kdy se u pacienta objeví neresekabilní CRLM, je indikována buď paliativní chemoterapie, nebo downsizing/konverzní chemoterapie. Pro druhou skupinu pacientů je nanejvýš důležité poskytnout co nejúčinnější léčbu v první linii, protože 10

Terapeutické okno je úzké a další klinická a/nebo radiologická progrese v terapii první volby může zabránit dalším onkologickým a chirurgickým intervencím. Fit pacienti mohou mít prospěch z tripletu 5-FU, oxaliplatiny a irinotekanu (FOLFOXIRI). Jedná se však o toxický režim a starším nebo méně zdatným pacientům se častěji nabízí dublet 5-FU a buď oxaliplatina, nebo irinotekan. Další význam může mít, když je chemoterapie kombinována s protilátkami zacílenými na VEGF nebo, u těch nádorů exprimujících KRAS divokého typu, na receptor EGF.

Ale možná nejcennější nastavení pro pacienta s předem neresekovatelnou nádorovou zátěží by bylo před zahájením jakékoli léčby.

Až u 50 % pacientů s kolorektálním karcinomem se vyvinou jaterní metastázy buď synchronní, nebo metachronní ve vztahu k detekci primárního nádoru[2]. Základem léčby je dnes kombinace resekce +/-ablace metastáz s předoperačním zvětšením objemu jater nebo bez něj a chemoterapie někdy v kombinaci s protilátkami[3].

Byla identifikována řada negativních prognostických faktorů, pokud jde o růst nádoru, ale také ve struktuře onkogenů v nádorech[4]. Přesto jedním z nejdůležitějších faktorů je odpověď metastáz na chemoterapii jak radiologicky, tak i v redukci nádorových markerů (CEA, CA19/9)[5, 6].

Stále máme velmi málo znalostí, zda metastázy budou reagovat na podanou terapii nebo ne. Nádor s mutací KRAS nebude reagovat na léčbu Erbituxem a mucinózní nádory jsou obvykle odolnější vůči jakékoli chemoterapii[7].

Pro hodnocení specifické odpovědi nádoru na léčbu byly zkoumány různé modely, ale většina z nich je pomalá nebo vykazuje smíšené výsledky[8]. Dnes je k predikci odpovědi na terapii nejpoužívanějším a ověřeným modelem xenograftu odvozeného od myšího pacienta (PDX), ale vyhodnocení onkologické terapie trvá měsíce [9]. Proto myší PDX model nelze použít pro klinické rozhodování. Organoidní kultury využívající nádory pocházející od pacienta jsou dobře používaným nástrojem in vitro screeningu se slibnými výsledky pro různé nádory[10]. Organoidy zachovávají genetické vlastnosti původní nádorové tkáně. Přesto jsou tyto modely pomalé, pokud jde o hodnocení tkáně pacientů pro rozhodnutí o léčbě a postrádají schopnost vyhodnotit metastatický nebo angiogenní potenciál.

Embrya zebrafish byla nedávno použita jako avatary pro rakovinu člověka, nejprve u hematogenních rakovin, ale v poslední době také u solidních rakovin, jako je PDAC, rakovina prsu a kolorektální rakovina[11-14].

Model má několik výhod, nejsilnější je vyhodnocení odpovědi pouze 3-5 dní po implantaci nádorové tkáně do embryí. Embrya jsou transparentní, takže růst a šíření nádoru lze detailně vizualizovat a kvantifikovat poloautomatickým způsobem[15]. Protože vlastní imunitní systém embryí zebry nereaguje do 8. dne [14], proč imunitní odpověď proti nádoru pochází z pacientových vlastních imunitních buněk, je to také důvod, proč v tomto modelu funguje přihojení xenoštěpu. Na druhou stranu. Zatím nestačí bioptická tkáň, ale k vytvoření těchto avatarů je potřeba alespoň kubický centimetr nádorové tkáně. Z tohoto důvodu jehlové biopsie neposkytují dostatek materiálu, ale v současných protokolech jsou potřebné resekované tkáně jaterního tumoru.

U embryí zebrafish bylo prokázáno, že buňky kolorektálního karcinomu rostou a hodnocení odpovědi na různé kombinace chemoterapie bylo úspěšné s velmi dobrou korelací s odpovědí u lidí[14]. Dosud nebyly provedeny klinické studie kolorektálních jaterních metastáz.

Ryby jsou chovány při průměrné teplotě 28 °C v recirkulačním systému s cyklem světlo-tma 14:10 h. Oplozená vajíčka zebřičky se získávají přirozeným pářením divokého typu AB kmene v našich zařízeních a vyvíjející se embrya jsou umístěna v inkubátoru při 28 °C podle Kimmela et al[19]. Před jakýmkoli zákrokem budou embrya anestetizována 0,02% trikainem. Nádorová tkáň odebraná z chirurgického vzorku histopatologem je kryokonzervována ponořením tkáně do kryozkumavek obsahujících kryokonzervační médium, přidáním zkumavek do kryoboxu a umístěním krabice do mrazáku -80 stupňů po dobu alespoň 24 hodin. Zkumavka s tkání je poté transportována na suchém ledu do laboratoře zebrafish, kde bude tkáň rozmražena, promyta a inkubována v proteázové směsi v mechanickém desagregačním zařízení (GentleMACS), aby se z tkáně vytvořila suspenze jedné buňky. Suspenze se filtruje a 30 minut inkubuje v 40 ug/ml CM-Dil ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), následuje centrifugace a promytí PBS. Značené buňky jsou poté resuspendovány v implantačním médiu a injikovány pomocí tenkých skleněných kapilárních jehel do subkutánního perivitelinního kompartmentu 2 dnů starých embryí zebrafish. Úspěšně implantovaná embrya zebrafish jsou poté přenesena do embryonálního média obsahujícího zkoumaná léčiva (např. léčiva, která by mohla být zvažována pro léčbu pacienta darujícího vzorek) a ošetřována po dobu tří dnů. Snímky nádorů se získají jak bezprostředně po transplantaci, tak po třídenním období léčby a další snímek hlavního metastatického místa v embryu zebrafish se pořídí po třídenním období léčby, aby se vyhodnotily metastatické schopnosti buněk. Výsledek léčby bude hodnocen jako změna objemu nádoru mezi dnem 3 a dnem 0 v léčené skupině ve srovnání s kontrolní skupinou s vehikulem (procenta) a významně silnější snížení objemu nádoru v léčené skupině bude považováno za pozitivní výsledek léčby . Důkaz prometastatického fenotypu bude odvozen z počtu buněk nalezených v metastatickém místě v embryích zebrafish tři dny po implantaci. U prvních 10–20 zahrnutých pacientů budou vyhodnoceny limitní úrovně pro počet metastázovaných buněk potřebných k předpovědi pravděpodobné metastatické progrese pacienta, protože takové informace nejsou v současnosti dostupné z jiných zdrojů informací.