Evaluering av svulstvekst og onkologisk behandling hos pasienter med CRLM ved bruk av embryomodell for sebrafisk (CRLM-Z)

Mulighetene for å forutsi onkologisk tumorrespons for individuelle pasienter med GI-maligniteter for å skreddersy en personlig onkologisk behandling, er foreløpig begrenset. Dette betyr at det meste av informasjonen som brukes for å bestemme onkologisk behandling, gjelder en gruppe pasienter i stedet for enkeltpersoner. Tilsvarende er de fleste kjemoterapiregimene som brukes ikke individuelt tilpasset, selv om det har vist seg å være gunstig for visse pasientkohorter. Ved kolorektal kreft forutsier KRAS (Kirsten rottesarkom) og BRAF-mutasjonsstatus responsen på legemidler rettet mot ulike trinn i EGFR/KRAS/BRAF-signalveien, mens MSI/MMR-status kan forutsi utfallet av immunkontrollpunkthemmere [1]. Siden kjemoterapi, så vel som andre kreftbehandlinger, kan ha alvorlige bivirkninger, kan behandlingen ikke bare være ineffektiv, men kan også forårsake alvorlige uønskede hendelser som til og med forkorter pasientens liv og hemmer sjansen for kurativ tumorreseksjon. Av denne grunn vil evaluering av respons før behandling i en avatarmodell av sebrafisk være mest verdifull.

Fra et klinisk synspunkt er den enkleste situasjonen i adjuvant setting. På dette tidspunktet er hele svulsten tilgjengelig for analyse, og større deler av vev kan brukes i avatarmodellen. 5-fluorouracil eller capecitabin (et 5-FU prodrug) enten alene eller i kombinasjon med oksaliplatin er gjeldende standard adjuvansbehandling ved stadium III tykktarmskreft og stadium II tykktarmskreft med 2+ risikofaktorer. Andre typer kombinasjonsregimer inkludert f.eks. irinotecan har så langt ikke vist nytte i adjuvanssituasjonen.

I neoadjuvant setting, dvs. preoperativ behandling til pasienter med resektabel CRLM, kan kombinasjoner av 5-FU (eller capecitabin) og enten oksaliplatin eller irinotekan forbedre resultatet av kirurgi og langtidsprognose. Det er foreløpig ikke kjent hvilket kur som er mest effektivt for den enkelte pasient.

I det mest alvorlige scenariet, hvor pasienten får uoperabel CRLM, er enten palliativ kjemoterapi eller nedbemanning/konverteringskjemoterapi indisert. For sistnevnte pasientgruppe er det av ytterste viktighet å gi så potent behandling som mulig i første linje, da de 10

Det terapeutiske vinduet er smalt og ytterligere klinisk og/eller radiologisk progresjon på førstelinjebehandlingen kan utelukke ytterligere onkologiske og kirurgiske inngrep. Fiterte pasienter kan ha nytte av en triplett av 5-FU, oksaliplatin og irinotekan (FOLFOXIRI). Dette er imidlertid et toksisk regime, og eldre eller mindre spreke pasienter tilbys oftere en dublett av 5-FU og enten oksaliplatin eller irinotekan. Det kan være en tilleggsverdi når kjemoterapien kombineres med antistoffer rettet mot VEGF eller, for de svulstene som uttrykker villtype KRAS, EGF-reseptoren.

Men kanskje den mest verdifulle innstillingen for pasienten med på forhånd ikke-opererbar tumorbyrde, ville være før noen behandling har startet.

Opptil 50 % av pasientene med tykktarmskreft vil utvikle levermetastaser enten synkrone eller metakrone i forhold til påvisning av primærtumor[2]. Grunnpilaren i behandlingen i dag er en kombinasjon av reseksjon +/-ablasjon av metastaser, med eller uten preoperativ levervolumforsterkning og kjemoterapi noen ganger i kombinasjon med antistoffer[3].

En rekke negative prognostiske faktorer er identifisert både angående tumorvekst, men også i mønsteret av onkogener i svulstene[4]. En av de viktigste faktorene er likevel responsen til metastaser på kjemoterapi både radiologisk, men også i reduksjon av tumormarkører (CEA, CA19/9)[5, 6].

Fortsatt har vi svært lite kunnskap om metastasene kommer til å svare på behandlingen som gis eller ikke. Tumor med KRAS-mutasjon vil ikke respondere på Erbitux-behandling, og slimete svulster er vanligvis mer motstandsdyktige mot kjemoterapi[7].

Ulike modeller har blitt utforsket for å evaluere tumorspesifikk respons på behandling, men de fleste er trege eller har vist blandede resultater[8]. I dag er musepasientavledet xenograft-modell (PDX) den mest brukte og validerte for å forutsi respons på terapi, men evaluering av onkologisk terapi tar måneder [9]. Derfor kan ikke muse-PDX-modellen brukes til klinisk beslutningstaking. Organoidkulturer som bruker pasientavledede kreftformer er et godt brukt in vitro-screeningsverktøy, med lovende resultater for forskjellige svulster[10]. Organoider opprettholder de genetiske egenskapene til det opprinnelige tumorvevet. Likevel er disse modellene trege når det gjelder å evaluere pasientens vev for behandlingsbeslutninger og mangler evnen til å evaluere metastatiske eller angiogene potensialer.

Nylig har sebrafiskembryoer blitt brukt som avatarer for kreft hos mennesker, først i hematogene kreftformer, men i det siste også i solide kreftformer som PDAC, brystkreft og tykktarmskreft [11-14].

Modellen har flere fordeler, den sterkeste er responsevaluering kun 3-5 dager etter at tumorvevet er implantert i embryoene. Embryoene er transparente slik at tumorvekst og spredning kan visualiseres i detalj og kvantifiseres på en semi-automatisk måte[15]. Siden sebrafiskembryoenes eget immunsystem ikke reagerer før dag 8 dager [14], hvorfor immunresponsen mot svulsten kommer fra pasientens egne immunceller, er dette også grunnen til at xenograft-engraftment fungerer i denne modellen. På den andre siden. Foreløpig er ikke biopsivev nok, men minst en kubikkcentimeter tumorvev er nødvendig for å generere disse avatarene. Av denne grunn gir nålebiopsier ikke nok materiale, men reseksjonert levertumorvev er nødvendig i de gjeldende protokollene.

I sebrafiskembryoer har kolorektale kreftceller vist seg å vokse og responsevaluering av forskjellige kjemoterapikombinasjoner har vært vellykket med meget god korrelasjon til responsen hos mennesker [14]. Kliniske studier på kolorektale levermetastaser er så langt ikke utført.

Fisk holdes ved en gjennomsnittstemperatur på 28 °C i et resirkuleringssystem med en 14:10 timers lys til mørk syklus. Sebrafisk befruktede egg oppnås ved naturlig parring av villtype AB-stamme ved våre anlegg, og de utviklende embryoene iscenesettes i inkubator ved 28 °C ifølge Kimmel et al.[19]. Før enhver prosedyre vil embryoer bli bedøvet i 0,02 % trikain. Svulstvevet tatt fra den kirurgiske prøven av histopatologen kryokonserveres ved å senke vevet i kryorør som inneholder kryokonserveringsmedium, tilsette rørene til en kryoboks og plassere boksen i en -80 graders fryser i minst 24 timer. Røret med vev blir deretter transportert på tørris til sebrafisklaboratoriet hvor vevet vil bli tint, vasket og inkubert i en proteaseblanding i en mekanisk disaggregeringsenhet (GentleMACS), for å produsere en enkelt cellesuspensjon fra vevet. Suspensjonen filtreres og inkuberes i 30 minutter i 40 μg/ml CM-Dil i fosfatbufret saltvann (PBS), etterfulgt av sentrifugering og vasking med PBS. De merkede cellene resuspenderes deretter i implantasjonsmedium og injiseres ved hjelp av tynne glasskapillærnåler i det subkutane perivitelline-rommet til 2 dager gamle sebrafiskembryoer. Vellykket implanterte sebrafiskembryoer overføres deretter til embryomedium som inneholder medikamentene som undersøkes (f.eks. legemidlene som kan vurderes for behandling av pasienten som donerer prøven) og behandles i tre dager. Bilder av svulstene erverves både umiddelbart etter transplantasjon og etter den tre dager lange behandlingsperioden, og et tilleggsbilde av hovedmetastaseringsstedet i sebrafiskembryoet tas etter den tre dager lange behandlingsperioden for å evaluere cellenes metastatiske evner. Behandlingsresultat vil bli evaluert som endring i tumorvolum mellom dag 3 og dag 0 i behandlingsgruppen sammenlignet med vehikelkontrollgruppen (prosent), og en betydelig sterkere reduksjon av tumorvolum i behandlingsgruppen vil bli vurdert som et positivt behandlingsresultat . Bevis for en pro-metastatisk fenotype vil bli avledet fra antall celler funnet på metastasestedet i sebrafiskembryoene tre dager etter implantasjon. Cut-off-nivåer for hvor mange metastaserte celler som kreves for å forutsi sannsynlig metastatisk progresjon hos pasienten, vil bli evaluert i de første 10-20 pasientene inkludert, da slik informasjon foreløpig ikke er tilgjengelig fra andre informasjonskilder.