プロテオミクスによるMASH関連HCCリスクの長期予測 (PROTEOMASH)

MASHは進行性の肝疾患であり、MASLDの重症型として認識されており、組織学的には肝臓の脂肪変性に肝細胞の炎症と風船様変性を伴うことが特徴です。 肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、脂質異常症などのメタボリックシンドローム構成要素との強い関連性により、MASHは増大する公衆衛生上の懸念となっています。 世界的に、MASLDの有病率は約25％と推定されており、MASHはこれらの患者の相当な部分、特に併存する代謝疾患を持つ患者に影響を及ぼしています。

MASHの進行は不均一であり、高度な線維症、肝硬変、肝細胞癌（HCC）につながる可能性があります。 重要なことに、肝硬変はHCCのよく知られた危険因子ですが、最近の疫学および臨床研究では、MASHに罹患した非肝硬変肝臓でもHCCが発生し得ることが示されています。 この現象は、現在のガイドラインが主に病因にかかわらず肝硬変患者にHCCスクリーニングを推奨しているため、監視と管理に関する臨床的意思決定を複雑にしています。

MASHとそのHCCへの進展の病因には、代謝異常、慢性肝炎症、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、リポトキシシティ、線維形成経路の活性化の間の複雑な相互作用が関与しています。 肝細胞内の遊離脂肪酸と毒性脂質代謝物の過剰蓄積は細胞ストレスを誘発し、炎症カスケードとアポトーシスを引き起こします。 クッパー細胞と動員された免疫細胞は炎症環境を持続させ、進行性線維症に寄与します。

MASH関連HCCの増加する発生率は、HCC発症リスクに応じて患者を正確に層別化できる新規バイオマーカーの緊急な必要性を強調しています。 高リスク個人の早期同定は、個別化された監視戦略、早期診断、適時の治療介入を可能にし、臨床転帰を改善する可能性があります。 残念ながら、アルファフェトプロテイン（AFP）を含む血清学的バイオマーカーは、MASH集団における早期HCC検出に対する感度と特異性が限られています。 したがって、MASHと肝発癌の基礎となる病態生理を反映する新規分子マーカーが積極的に研究されています。

プロテオミクスは、細胞や組織によって発現されるタンパク質の大規模研究であり、MASHとHCCにおけるバイオマーカー発見に独自の利点を提供します。 タンパク質は細胞プロセスの機能的エフェクターであり、ゲノムまたはトランスクリプトミクスデータのみと比較して動的な病理学的変化をよりよく反映する可能性があります。

質量分析法による組織プロテオミクスプロファイリングは、予後プロテオミクスシグネチャーを同定するのに適した革新的で有望なツールです。 この方法論は、U1312 BRIC研究所（チーム3、肝臓癌と腫瘍浸潤）でOncoprotプラットフォーム（UMS 005-TBMcore）との協力により開発されました。 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織標本から開始し、関心領域を選択し、レーザーマイクロダイセクションを行います。 次に、タンパク質を抽出し、固定を逆転し、トリプシンを用いてタンパク質を消化します。 得られたペプチドは、高分解能質量分析計による液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）で分析されます。 データ処理はバイオインフォマティシャンによって行われます：各サンプルは参照サンプル（例：健康な肝組織）と比較され、相対的タンパク質発現強度（タンパク質存在比）の計算が可能になります。 次に、2つのサンプルを三角測定量化法を用いて比較できます。これは、サンプル間のタンパク質存在比を比較することを含みます。 2つのサンプル間で存在比が有意に異なるすべてのタンパク質がプロテオミクスプロファイルを構成します。

質量分析法に基づくプロテオミクス技術の進歩により、診断的肝生検中に日常的に収集されるホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）標本を含む少量の組織からのタンパク質発現プロファイルの高スループット、高感度、定量的分析が可能になりました。 これにより、十分に特徴付けられた患者コホートの遡及的分析が可能になり、プロテオミクスデータと臨床転帰の統合が容易になります。

研究デザインと方法論 本研究は、ボルドー大学病院（CHU）のn=30患者コホートの遡及的分析に基づいており、生物学的サンプルと臨床データは既に日常診療の一環として収集されています。 MASLD（代謝関連脂肪性肝炎）の悪性転換は長いプロセス（数年）であるため、この遡及的アプローチは研究の実現可能性と結果の迅速な取得を保証します。

述べられた仮説に対処するため、本研究は、ボルドーCHU肝臓内科コホートの患者からの臨床データの遡及的分析（ClinicalTrials.gov識別子NCT01241227およびNCT02060565に登録）と、ボルドーCHU癌バイオバンク（CRB）で利用可能な同じ患者からの肝生検のプロテオミクス分析に依存します。 ボルドーCHUコホートは現在、診断時に登録され現在まで前向きに追跡されている7000人以上のMASLD患者を含みます。 最初の患者は2003年に登録され、早期登録者には最大20年の追跡調査が提供されており、このコホートは悪性転換リスクを研究するための貴重なリソースとなっています。

臨床データは既存のデータベース内で標準化された手順を用いて収集されており、このプロジェクトのデータ品質と完全性を保証します。 ProteoMASH研究に含まれる患者の肝生検からのプロテオミクスデータは、Inserm U1312に設立された専用データベースから取得され、CHUデータベースからの臨床データ（追跡調査中の肝細胞癌[HCC]の発症、診断からの追跡期間、糖尿病の有無など）と相互参照され、これらの新規生物学的マーカーの診断的および予後的価値を検証することを目指します。

本研究では、日常臨床診療中に得られた生検断片を使用します。 臨床データはサービスデータベース内の患者医療記録から抽出されます；追跡調査データは標準的ケアの一環として収集されるため、患者に追加の手順や追跡調査訪問は課されません。

ボルドーCHUコホートの患者は2つのサブグループに分類されます：

• グループ1（n=15）：HCC発症前にMASLDと診断された肝生検を受け、生検とHCC診断の間の時間間隔が1年から15年の範囲にある患者。
• グループ2（n=15）：追跡調査中にHCCを発症しなかった、MASLDと診断された肝生検を受けた対照患者。

遡及的コホートに固有の潜在的なバイアスは、可能な限り効果的に制御されます：

対照患者（グループ2）は、年齢、性別、糖尿病の有無とコントロール（フランスのガイドラインに従いHbA1c <8%で定義）、線維化段階（組織学的にF0：線維化なしからF4：肝硬変まで定義）などの既知のHCC危険因子を考慮して選択されます。 目的は、これらの危険因子がグループ間で同様に分布していることを確保することです。

さらに、グループ2の患者が少なくとも5年間、画像検査（超音波、CTスキャン、またはMRI）による支持を受けて追跡され、HCCが見逃される可能性がなかったことを確認します。

グループ1では、分類バイアスを最小限に抑えるため、画像検査（アメリカ放射線学会のLI-RADS基準に従ったCTまたはMRI）または組織病理学（新たな生検または外科的切除）に基づくHCCの客観的診断基準が使用されます。 さらに、肝生検時に潜在的なHCCの可能性を排除するため、生検後1年以上経過してHCCと診断された患者のみが含まれ、生検後少なくとも1年後およびHCC診断前に画像検査（超音波、CT、またはMRI）でHCCの不在が確認されます。

別の潜在的なバイアスは、追跡調査から脱落した患者（例：他のセンターで追跡調査を受けている、15年以内にHCCを発症せずに死亡した）に関連し、これらは分析から除外され、異なるHCCリスクを持つ可能性があります。 したがって、グループ2の患者がHCCを発症しないすべてのMASLD患者を完全に代表していると確信することはできません。 しかし、この制限はProteoMASH研究の探索的性質によって正当化され、将来のプロジェクトで考慮されます。

さらに、患者は時間経過による医療管理の変化による交絡を避けるため、均質な期間にわたって含まれます。

最後に、既存のデータベースで既に利用可能な日常的に収集された臨床データ（例：糖尿病コントロールのためのHbA1c値、組織学的に定義された線維化段階）を使用して、欠測データバイアスを最小限に抑えます。

肝臓FFPE生検は最適化されたプロテオミクスワークフローを受け、得られたプロテオミクスデータセットはバイオインフォマティクスパイプラインを用いて分析され、HCC群と非HCC群の間で発現が異なるタンパク質またはパネルを同定します。 同定されたタンパク質は、その生物学的機能、経路、および肝発癌への関与について注釈が付けられます。

臨床的および研究的意義 MASH患者におけるHCCリスクのための堅牢なプロテオミクスバイオマーカーの同定は、深遠な臨床的意義を持つ可能性があります。 そのようなバイオマーカーを臨床ワークフローに組み込むことで、線維化段階のみを超えたリスク層別化アルゴリズムを洗練させ、個々の分子リスクプロファイルに合わせた個別化された監視スケジュールを可能にすることができます。

さらに、プロテオミクスバイオマーカーは、MASHと早期HCCの新興薬理学的介入における治療標的または治療反応の指標として機能し、精密医療アプローチを促進する可能性があります。

将来の研究は、これらのバイオマーカーをより大規模な多施設コホートで検証し、プロテオミクスデータを他のオミクスモダリティ（ゲノミクス、メタボロミクス）および臨床パラメータと統合することに焦点を当てるべきです。 縦断的サンプリングと連続的プロテオミクス分析は、疾患進行とバイオマーカー変動の時間的ダイナミクスを解明する可能性があります。

結論 結論として、代謝関連脂肪性肝炎患者からのFFPE肝生検標本への組織プロテオミクスの応用は、肝細胞癌リスクを予測する新規バイオマーカーを同定するための有望な戦略を表しています。 このアプローチは、現在の診断方法の重要な限界に対処し、MASHに影響を受ける増加する集団における改善された早期発見、個別化されたリスク評価、そして最終的により良い患者転帰への道筋を提供します。