Predicción a Largo Plazo del Riesgo de CHC Relacionado con MASH mediante Proteómica (PROTEOMASH)

Introducción La EHmetA es una enfermedad hepática progresiva, reconocida como una forma grave de EHNA, caracterizada histológicamente por esteatosis hepática acompañada de inflamación hepatocelular y degeneración balonizante. Representa una preocupación creciente de salud pública debido a su fuerte asociación con componentes del síndrome metabólico como la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes mellitus tipo 2, la hipertensión y la dislipidemia. A nivel mundial, se estima que la prevalencia de EHNA es aproximadamente del 25%, y la EHmetA afecta a un subconjunto sustancial de estos pacientes, particularmente aquellos con trastornos metabólicos comórbidos.

La progresión de la EHmetA es heterogénea y puede conducir a fibrosis avanzada, cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). Es importante destacar que, aunque la cirrosis es un factor de riesgo bien conocido para el CHC, estudios epidemiológicos y clínicos recientes han demostrado que el CHC también puede desarrollarse en hígados no cirróticos afectados por EHmetA. Este fenómeno complica la toma de decisiones clínicas respecto a la vigilancia y el manejo, ya que las guías actuales recomiendan principalmente el cribado de CHC en pacientes con cirrosis, independientemente de la etiología.

La patogénesis de la EHmetA y su progresión a CHC implica interacciones complejas entre alteraciones metabólicas, inflamación hepática crónica, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, lipotoxicidad y activación de vías fibrogénicas. La acumulación excesiva de ácidos grasos libres y metabolitos lipídicos tóxicos en los hepatocitos induce estrés celular, desencadenando cascadas inflamatorias y apoptosis. Las células de Kupffer y las células inmunitarias reclutadas perpetúan el entorno inflamatorio, contribuyendo a la fibrosis progresiva.

La incidencia creciente de CHC relacionado con EHmetA subraya la necesidad urgente de nuevos biomarcadores capaces de estratificar con precisión a los pacientes según su riesgo de desarrollo de CHC. La identificación temprana de individuos de alto riesgo permitiría estrategias de vigilancia personalizadas, diagnóstico precoz e intervenciones terapéuticas oportunas, mejorando potencialmente los resultados clínicos. Desafortunadamente, los biomarcadores serológicos, incluida la alfa-fetoproteína (AFP), tienen sensibilidad y especificidad limitadas para la detección temprana de CHC en la población con EHmetA. Por lo tanto, se están investigando activamente nuevos marcadores moleculares que reflejen la fisiopatología subyacente de la EHmetA y la hepatocarcinogénesis.

La proteómica, el estudio a gran escala de las proteínas expresadas por células o tejidos, ofrece ventajas únicas para el descubrimiento de biomarcadores en EHmetA y CHC. Las proteínas son los efectores funcionales de los procesos celulares y pueden reflejar mejor los cambios patológicos dinámicos en comparación con los datos genómicos o transcriptómicos por sí solos.

El perfil proteómico tisular mediante espectrometría de masas es una herramienta innovadora y prometedora muy adecuada para la identificación de firmas proteómicas pronósticas. Esta metodología fue desarrollada en el laboratorio U1312 BRIC (equipo 3, Cánceres Hepáticos e Invasión Tumoral) en colaboración con la plataforma Oncoprot (UMS 005-TBMcore). Partiendo de una muestra de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE), se selecciona una región de interés y se realiza microdisección láser. Luego, las proteínas se extraen, se revierte la fijación y las proteínas se digieren usando tripsina. Los péptidos resultantes se analizan posteriormente mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en un espectrómetro de masas de alta resolución. El procesamiento de datos lo realiza un bioinformático: cada muestra se compara con una muestra de referencia (por ejemplo, tejido hepático sano), permitiendo calcular las intensidades de expresión proteica relativa (ratios de abundancia proteica). Luego, dos muestras pueden compararse usando un método de cuantificación por triangulación, que implica comparar los ratios de abundancia proteica entre las muestras. Todas las proteínas que exhiben ratios de abundancia significativamente diferentes entre las dos muestras constituyen el perfil proteómico.

Los avances en las tecnologías proteómicas basadas en espectrometría de masas ahora permiten un análisis de alto rendimiento, sensible y cuantitativo de los perfiles de expresión proteica a partir de pequeñas cantidades de tejido, incluidas muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) recolectadas rutinariamente durante biopsias hepáticas diagnósticas. Esto permite análisis retrospectivos de cohortes de pacientes bien caracterizadas y facilita la integración de datos proteómicos con resultados clínicos.

Diseño del Estudio y Metodología Este estudio se basa en el análisis retrospectivo de una cohorte de n=30 pacientes del Hospital Universitario de Burdeos (CHU), con muestras biológicas y datos clínicos ya recolectados como parte de la atención rutinaria. Dado que la transformación maligna de la EHNA (Esteatohepatitis Asociada a Metabolismo) es un proceso largo (varios años), este enfoque retrospectivo asegura la viabilidad del estudio y la adquisición rápida de resultados.

Para abordar las hipótesis planteadas, este estudio se basará en el análisis retrospectivo de datos clínicos de pacientes de la cohorte del departamento de hepatología del CHU de Burdeos (registrados bajo los identificadores de ClinicalTrials.gov NCT01241227 y NCT02060565), así como en el análisis proteómico de biopsias hepáticas de los mismos pacientes, disponibles en el Biobanco de Cáncer del CHU de Burdeos (CRB). La cohorte del CHU de Burdeos incluye actualmente más de 7000 pacientes con EHNA inscritos al diagnóstico y seguidos prospectivamente hasta la fecha. El primer paciente fue incluido en 2003, proporcionando hasta 20 años de seguimiento para los inscritos tempranamente, lo que convierte a esta cohorte en un recurso valioso para estudiar el riesgo de transformación maligna.

Los datos clínicos se han recolectado utilizando un procedimiento estandarizado dentro de una base de datos existente, asegurando la calidad e integridad de los datos para este proyecto. Los datos proteómicos de biopsias hepáticas de pacientes incluidos en el estudio ProteoMASH se recuperarán de una base de datos dedicada establecida en Inserm U1312 y se cruzarán con datos clínicos de la base de datos del CHU (como el desarrollo de carcinoma hepatocelular [CHC] durante el seguimiento, duración del seguimiento desde el diagnóstico, presencia de diabetes, etc.), con el objetivo de validar el valor diagnóstico y pronóstico de estos nuevos marcadores biológicos.

Para este estudio, utilizaremos fragmentos de biopsia obtenidos durante la atención clínica rutinaria. Los datos clínicos se extraerán de los registros médicos de los pacientes dentro de la base de datos del servicio; no se impondrán procedimientos adicionales ni visitas de seguimiento a los pacientes, ya que los datos de seguimiento se recopilan como parte de la atención estándar.

Los pacientes de la cohorte del CHU de Burdeos se clasificarán en dos subgrupos:

• Grupo 1 (n=15): pacientes con una biopsia hepática diagnóstica de EHNA antes del desarrollo de CHC, con un intervalo de tiempo entre la biopsia y el diagnóstico de CHC que oscila entre 1 y 15 años.
• Grupo 2 (n=15): pacientes control con una biopsia hepática diagnóstica de EHNA que no desarrollaron CHC durante el seguimiento.

Los posibles sesgos inherentes a las cohortes retrospectivas se controlarán de la manera más efectiva posible:

Los pacientes control (Grupo 2) se seleccionarán teniendo en cuenta factores de riesgo conocidos de CHC como la edad, el sexo, la presencia y control de la diabetes (definida por HbA1c <8% según las guías francesas) y el estadio de fibrosis (definido histológicamente desde F0: sin fibrosis hasta F4: cirrosis). El objetivo es asegurar que estos factores de riesgo estén distribuidos de manera similar entre los grupos.

Además, nos aseguraremos de que los pacientes del Grupo 2 hayan sido seguidos durante al menos 5 años con apoyo de imagen (ecografía, tomografía computarizada o resonancia magnética) para confirmar que no se haya pasado por alto ningún CHC.

Para el Grupo 1, se utilizarán criterios diagnósticos objetivos para CHC, basados en imagen (TC o RM siguiendo los criterios LI-RADS del Colegio Americano de Radiología) o histopatología (nueva biopsia o resección quirúrgica), para minimizar el sesgo de clasificación. Además, para excluir la posibilidad de CHC oculto en el momento de la biopsia hepática, solo se incluirán pacientes con CHC diagnosticado más de un año después de la biopsia, con imágenes (ecografía, TC o RM) que confirmen la ausencia de CHC al menos un año después de la biopsia y antes del diagnóstico de CHC.

Otro sesgo potencial se relaciona con los pacientes perdidos durante el seguimiento (por ejemplo, seguidos en otros centros, fallecidos antes de los 15 años sin desarrollo de CHC), que serán excluidos del análisis y podrían tener un riesgo diferente de CHC. Por lo tanto, no podemos estar seguros de que los pacientes del Grupo 2 representen completamente a todos los pacientes con EHNA que no desarrollan CHC. Sin embargo, esta limitación está justificada por la naturaleza exploratoria del estudio ProteoMASH y se considerará en proyectos futuros.

Además, los pacientes se incluirán en períodos de tiempo homogéneos para evitar confusión debido a cambios en el manejo médico a lo largo del tiempo.

Finalmente, se utilizarán datos clínicos recolectados rutinariamente ya disponibles en la base de datos existente (por ejemplo, valores de HbA1c para el control de la diabetes, estadio de fibrosis definido histológicamente) para minimizar el sesgo por datos faltantes.

Las biopsias hepáticas FFPE se someterán a flujos de trabajo proteómicos optimizados y los conjuntos de datos proteómicos resultantes se analizarán utilizando pipelines bioinformáticos para identificar proteínas o paneles expresados de manera diferencial entre los grupos con CHC y sin CHC. Las proteínas identificadas se anotarán por sus funciones biológicas, vías e implicación en la hepatocarcinogénesis.

Implicaciones Clínicas y de Investigación La identificación de biomarcadores proteómicos robustos para el riesgo de CHC en pacientes con EHmetA puede tener profundas implicaciones clínicas. La incorporación de dichos biomarcadores en los flujos de trabajo clínicos podría refinar los algoritmos de estratificación de riesgo más allá de la estadificación de la fibrosis por sí sola, permitiendo programas de vigilancia personalizados adaptados a los perfiles de riesgo molecular individuales.

Además, los biomarcadores proteómicos pueden servir como dianas terapéuticas o indicadores de respuesta al tratamiento en intervenciones farmacológicas emergentes para EHmetA y CHC temprano, facilitando enfoques de medicina de precisión.

Los estudios futuros deberían centrarse en validar estos biomarcadores en cohortes más grandes y multicéntricas e integrar datos proteómicos con otras modalidades ómicas (genómica, metabolómica) y parámetros clínicos. El muestreo longitudinal y los análisis proteómicos seriados podrían dilucidar las dinámicas temporales de la progresión de la enfermedad y las fluctuaciones de los biomarcadores.

Conclusión En conclusión, la aplicación de la proteómica tisular a especímenes de biopsia hepática FFPE de pacientes con esteatohepatitis asociada a metabolismo representa una estrategia prometedora para identificar nuevos biomarcadores predictivos del riesgo de carcinoma hepatocelular. Este enfoque aborda limitaciones críticas de los métodos diagnósticos actuales y ofrece un camino hacia una mejor detección temprana, evaluación de riesgo personalizada y, en última instancia, mejores resultados para los pacientes en la población creciente afectada por EHmetA.