Długoterminowa predykcja ryzyka HCC związanego z MASH za pomocą proteomiki (PROTEOMASH)

Wprowadzenie MASH to postępująca choroba wątroby, uznawana za ciężką postać MASLD, charakteryzująca się histologicznie stłuszczeniem wątroby z towarzyszącym zapaleniem hepatocytów i zwyrodnieniem balonowatym. Stanowi ona rosnący problem zdrowia publicznego ze względu na silny związek ze składnikami zespołu metabolicznego, takimi jak otyłość, insulinooporność, cukrzyca typu 2, nadciśnienie tętnicze i dyslipidemia. Na całym świecie częstość występowania MASLD szacuje się na około 25%, przy czym MASH dotyka znaczną podgrupę tych pacjentów, szczególnie tych ze współistniejącymi zaburzeniami metabolicznymi.

Progresja MASH jest heterogenna i może prowadzić do zaawansowanego włóknienia, marskości oraz raka wątrobowokomórkowego (HCC). Co ważne, podczas gdy marskość jest dobrze znanym czynnikiem ryzyka HCC, ostatnie badania epidemiologiczne i kliniczne wykazały, że HCC może również rozwijać się w niezmienionych marskością wątrobach dotkniętych MASH. Zjawisko to komplikuje podejmowanie decyzji klinicznych dotyczących nadzoru i leczenia, ponieważ obecne wytyczne zalecają przede wszystkim badania przesiewowe w kierunku HCC u pacjentów z marskością, niezależnie od etiologii.

Patogeneza MASH i jej progresja do HCC obejmuje złożone interakcje między zaburzeniami metabolicznymi, przewlekłym zapaleniem wątroby, stresem oksydacyjnym, dysfunkcją mitochondriów, lipotoksycznością i aktywacją szlaków fibrogennych. Nadmierne gromadzenie wolnych kwasów tłuszczowych i toksycznych metabolitów lipidów w hepatocytach indukuje stres komórkowy, wywołując kaskady zapalne i apoptozę. Komórki Kupffera i rekrutowane komórki odpornościowe utrwalają środowisko zapalne, przyczyniając się do postępującego włóknienia.

Rosnąca częstość występowania HCC związanego z MASH podkreśla pilną potrzebę nowych biomarkerów zdolnych do dokładnego stratyfikowania pacjentów według ryzyka rozwoju HCC. Wczesna identyfikacja osób wysokiego ryzyka umożliwiłaby dostosowanie strategii nadzoru, wczesną diagnozę i terminowe interwencje terapeutyczne, potencjalnie poprawiając wyniki kliniczne. Niestety, biomarkery serologiczne, w tym alfa-fetoproteina (AFP), mają ograniczoną czułość i specyficzność w wykrywaniu wczesnego HCC w populacji MASH. Dlatego aktywnie bada się nowe markery molekularne odzwierciedlające podstawową patofizjologię MASH i hepatokarcinogenezy.

Proteomika, czyli szeroko zakrojone badanie białek eksprymowanych przez komórki lub tkanki, oferuje unikalne korzyści w odkrywaniu biomarkerów w MASH i HCC. Białka są funkcjonalnymi efektorami procesów komórkowych i mogą lepiej odzwierciedlać dynamiczne zmiany patologiczne w porównaniu z samymi danymi genomowymi lub transkryptomicznymi.

Profilowanie proteomiczne tkanek za pomocą spektrometrii mas jest innowacyjnym i obiecującym narzędziem dobrze nadającym się do identyfikacji prognostycznych sygnatur proteomicznych. Metodologia ta została opracowana w laboratorium U1312 BRIC (zespół 3, Nowotwory wątroby i inwazja guza) we współpracy z platformą Oncoprot (UMS 005-TBMcore). Poczynając od próbki tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie (FFPE), wybiera się obszar zainteresowania i przeprowadza mikrodysekcję laserową. Następnie ekstrahuje się białka, odwraca się utrwalenie, a białka trawi się za pomocą trypsyny. Powstałe peptydy są następnie analizowane za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS) na spektrometrze mas wysokiej rozdzielczości. Przetwarzanie danych przeprowadza bioinformatyk: każda próbka jest porównywana z próbką referencyjną (np. zdrową tkanką wątroby), co pozwala obliczyć względne intensywności ekspresji białek (współczynniki obfitości białek). Następnie dwie próbki można porównać za pomocą metody triangulacji ilościowej, która polega na porównaniu współczynników obfitości białek między próbkami. Wszystkie białka wykazujące istotnie różne współczynniki obfitości między dwiema próbkami stanowią profil proteomiczny.

Postępy w technologiach proteomicznych opartych na spektrometrii mas umożliwiają obecnie wysokoprzepustową, czułą i ilościową analizę profili ekspresji białek z małych ilości tkanki, w tym próbek utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie (FFPE) rutynowo pobieranych podczas diagnostycznych biopsji wątroby. Pozwala to na retrospektywne analizy dobrze scharakteryzowanych kohort pacjentów i ułatwia integrację danych proteomicznych z wynikami klinicznymi.

Projekt badania i metodologia Badanie to opiera się na retrospektywnej analizie kohorty n=30 pacjentów z Uniwersyteckiego Szpitala w Bordeaux (CHU), u których próbki biologiczne i dane kliniczne zostały już zebrane w ramach rutynowej opieki. Ponieważ złośliwa transformacja MASLD (Metabolicznie Związane Stłuszczeniowe Zapalenie Wątroby) jest długim procesem (kilka lat), to retrospektywne podejście zapewnia wykonalność badania i szybkie uzyskanie wyników.

Aby odpowiedzieć na postawione hipotezy, badanie to będzie opierać się na retrospektywnej analizie danych klinicznych pacjentów z kohorty oddziału hepatologii CHU Bordeaux (zarejestrowanej pod identyfikatorami ClinicalTrials.gov NCT01241227 i NCT02060565), a także na analizie proteomicznej biopsji wątroby tych samych pacjentów, dostępnych w Biobanku Nowotworów CHU Bordeaux (CRB). Kohorta Bordeaux CHU obejmuje obecnie ponad 7000 pacjentów z MASLD włączonych w momencie rozpoznania i obserwowanych prospektywnie do chwili obecnej. Pierwszy pacjent został włączony w 2003 roku, co daje do 20 lat obserwacji dla wcześnie włączonych, czyniąc tę kohortę cennym zasobem do badania ryzyka transformacji złośliwej.

Dane kliniczne zostały zebrane przy użyciu ustandaryzowanej procedury w istniejącej bazie danych, zapewniając jakość i kompletność danych dla tego projektu. Dane proteomiczne z biopsji wątroby pacjentów włączonych do badania ProteoMASH zostaną pobrane z dedykowanej bazy danych utworzonej w Inserm U1312 i skrzyżowane z danymi klinicznymi z bazy danych CHU (takimi jak rozwój raka wątrobowokomórkowego [HCC] w trakcie obserwacji, czas obserwacji od rozpoznania, obecność cukrzycy itp.), mając na celu walidację wartości diagnostycznej i prognostycznej tych nowych markerów biologicznych.

W tym badaniu wykorzystamy fragmenty biopsji uzyskane podczas rutynowej opieki klinicznej. Dane kliniczne zostaną wyodrębnione z dokumentacji medycznej pacjentów w bazie danych oddziału; pacjenci nie będą poddawani dodatkowym procedurom ani wizytom kontrolnym, ponieważ dane z obserwacji są zbierane w ramach standardowej opieki.

Pacjenci z kohorty Bordeaux CHU zostaną sklasyfikowani do dwóch podgrup:

• Grupa 1 (n=15): pacjenci z biopsją wątroby diagnostyczną dla MASLD przed rozwojem HCC, z odstępem czasowym między biopsją a rozpoznaniem HCC wynoszącym od 1 do 15 lat.
• Grupa 2 (n=15): pacjenci kontrolni z biopsją wątroby diagnostyczną dla MASLD, u których nie rozwinęło się HCC w trakcie obserwacji.

Potencjalne błędy systematyczne właściwe dla kohort retrospektywnych będą kontrolowane tak skutecznie, jak to możliwe:

Pacjenci kontrolni (Grupa 2) będą wybierani z uwzględnieniem znanych czynników ryzyka HCC, takich jak wiek, płeć, obecność i kontrola cukrzycy (zdefiniowanej przez HbA1c <8% zgodnie z francuskimi wytycznymi) oraz stopień włóknienia (zdefiniowany histologicznie od F0: brak włóknienia do F4: marskość). Celem jest zapewnienie, że te czynniki ryzyka są podobnie rozłożone między grupami.

Dodatkowo zapewnimy, że pacjenci z Grupy 2 byli obserwowani przez co najmniej 5 lat z wsparciem obrazowym (USG, TK lub MRI), aby potwierdzić, że nie przeoczono HCC.

Dla Grupy 1 zostaną użyte obiektywne kryteria diagnostyczne HCC, oparte na obrazowaniu (TK lub MRI zgodnie z kryteriami LI-RADS Amerykańskiego Kolegium Radiologii) lub histopatologii (nowa biopsja lub resekcja chirurgiczna), aby zminimalizować błąd klasyfikacji. Ponadto, aby wykluczyć możliwość utajonego HCC w czasie biopsji wątroby, włączani będą tylko pacjenci z HCC rozpoznanym ponad rok po biopsji, z obrazowaniem (USG, TK lub MRI) potwierdzającym brak HCC co najmniej rok po biopsji i przed rozpoznaniem HCC.

Inny potencjalny błąd dotyczy pacjentów utraconych z obserwacji (np. obserwowanych w innych ośrodkach, zmarłych przed 15 lat bez rozwoju HCC), którzy zostaną wykluczeni z analizy i mogą mieć inne ryzyko HCC. Dlatego nie możemy być pewni, że pacjenci z Grupy 2 w pełni reprezentują wszystkich pacjentów z MASLD, u których nie rozwija się HCC. Jednak to ograniczenie jest uzasadnione eksploracyjnym charakterem badania ProteoMASH i będzie brane pod uwagę w przyszłych projektach.

Ponadto pacjenci będą włączani w jednorodnych okresach czasowych, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych zmianami w postępowaniu medycznym na przestrzeni czasu.

Wreszcie, rutynowo zbierane dane kliniczne już dostępne w istniejącej bazie danych (np. wartości HbA1c dla kontroli cukrzycy, histologicznie zdefiniowany stopień włóknienia) zostaną wykorzystane, aby zminimalizować błąd związany z brakami danych.

Biopsje FFPE wątroby przejdą zoptymalizowane procedury proteomiczne, a powstałe zbiory danych proteomicznych zostaną przeanalizowane przy użyciu potoków bioinformatycznych w celu identyfikacji białek lub paneli różnicowo eksprymowanych między grupami HCC i nie-HCC. Zidentyfikowane białka zostaną opisane pod kątem ich funkcji biologicznych, szlaków i zaangażowania w hepatokarcinogenezę.

Implikacje kliniczne i badawcze Identyfikacja solidnych biomarkerów proteomicznych dla ryzyka HCC u pacjentów z MASH może mieć głębokie implikacje kliniczne. Włączenie takich biomarkerów do przepływów pracy klinicznej mogłoby udoskonalić algorytmy stratyfikacji ryzyka wykraczające poza sam stopień włóknienia, umożliwiając spersonalizowane harmonogramy nadzoru dostosowane do indywidualnych profili ryzyka molekularnego.

Ponadto biomarkery proteomiczne mogą służyć jako cele terapeutyczne lub wskaźniki odpowiedzi na leczenie w nowych interwencjach farmakologicznych dla MASH i wczesnego HCC, ułatwiając podejścia medycyny precyzyjnej.

Przyszłe badania powinny skupić się na walidacji tych biomarkerów w większych, wieloośrodkowych kohortach i integracji danych proteomicznych z innymi modalnościami omicznymi (genomika, metabolomika) i parametrami klinicznymi. Pobieranie próbek w czasie i szeregowe analizy proteomiczne mogłyby wyjaśnić dynamikę czasową progresji choroby i fluktuacji biomarkerów.

Podsumowanie Podsumowując, zastosowanie proteomiki tkankowej do próbek biopsji wątroby FFPE od pacjentów z metabolicznie związanym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby stanowi obiecującą strategię identyfikacji nowych biomarkerów predykcyjnych dla ryzyka raka wątrobowokomórkowego. Podejście to rozwiązuje kluczowe ograniczenia obecnych metod diagnostycznych i oferuje ścieżkę do poprawy wczesnego wykrywania, spersonalizowanej oceny ryzyka i ostatecznie lepszych wyników pacjentów w rosnącej populacji dotkniętej MASH.