Previsão a Longo Prazo do Risco de CHC Relacionado com MASH por Proteómica (PROTEOMASH)

Introdução A MASH é uma doença hepática progressiva, reconhecida como uma forma grave de MASLD, caracterizada histologicamente por esteatose hepática acompanhada de inflamação hepatocelular e degeneração balonizante. Representa uma preocupação crescente de saúde pública devido à sua forte associação com componentes da síndrome metabólica, como obesidade, resistência à insulina, diabetes mellitus tipo 2, hipertensão e dislipidemia. Globalmente, estima-se que a prevalência de MASLD seja de aproximadamente 25%, com a MASH a afetar uma subconjunto substancial destes doentes, particularmente aqueles com comorbilidades metabólicas.

A progressão da MASH é heterogénea e pode levar a fibrose avançada, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Importante notar que, embora a cirrose seja um fator de risco bem conhecido para o CHC, estudos epidemiológicos e clínicos recentes demonstraram que o CHC também pode desenvolver-se em fígados não cirróticos afetados pela MASH. Este fenómeno complica a tomada de decisões clínicas relativamente à vigilância e gestão, uma vez que as diretrizes atuais recomendam principalmente o rastreio de CHC em doentes com cirrose, independentemente da etiologia.

A patogénese da MASH e sua progressão para CHC envolve interações complexas entre distúrbios metabólicos, inflamação hepática crónica, stresse oxidativo, disfunção mitocondrial, lipotoxicidade e ativação de vias fibrogénicas. O acúmulo excessivo de ácidos gordos livres e metabolitos lipídicos tóxicos nos hepatócitos induz stresse celular, desencadeando cascatas inflamatórias e apoptose. As células de Kupffer e células imunes recrutadas perpetuam o meio inflamatório, contribuindo para fibrose progressiva.

A incidência crescente de CHC relacionado com MASH sublinha a necessidade urgente de novos biomarcadores capazes de estratificar com precisão os doentes de acordo com o seu risco de desenvolvimento de CHC. A identificação precoce de indivíduos de alto risco permitiria estratégias de vigilância personalizadas, diagnóstico precoce e intervenções terapêuticas atempadas, potencialmente melhorando os resultados clínicos. Infelizmente, biomarcadores serológicos, incluindo a alfa-fetoproteína (AFP), têm sensibilidade e especificidade limitadas para a deteção precoce de CHC na população com MASH. Assim, novos marcadores moleculares que reflitam a fisiopatologia subjacente da MASH e da hepatocarcinogénese estão a ser ativamente investigados.

A proteómica, o estudo em larga escala das proteínas expressas por células ou tecidos, oferece vantagens únicas para a descoberta de biomarcadores na MASH e no CHC. As proteínas são os efetores funcionais dos processos celulares e podem refletir melhor as alterações patológicas dinâmicas em comparação com dados genómicos ou transcriptómicos isoladamente.

O perfil proteómico tecidual por espectrometria de massa é uma ferramenta inovadora e promissora bem adequada para a identificação de assinaturas proteómicas prognósticas. Esta metodologia foi desenvolvida no laboratório U1312 BRIC (equipa 3, Cancros do Fígado e Invasão Tumoral) em colaboração com a plataforma Oncoprot (UMS 005-TBMcore). Partindo de uma amostra de tecido fixada em formalina e incluída em parafina (FFPE), uma região de interesse é selecionada e microdissecada a laser. As proteínas são então extraídas, a fixação é revertida, e as proteínas são digeridas usando tripsina. Os péptidos resultantes são subsequentemente analisados por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) num espectrómetro de massa de alta resolução. O processamento de dados é realizado por um bioinformático: cada amostra é comparada com uma amostra de referência (por exemplo, tecido hepático saudável), permitindo o cálculo de intensidades de expressão proteica relativa (proporções de abundância proteica). Duas amostras podem então ser comparadas usando um método de quantificação por triangulação, que envolve comparar as proporções de abundância proteica entre as amostras. Todas as proteínas que exibem proporções de abundância significativamente diferentes entre as duas amostras constituem o perfil proteómico.

Os avanços nas tecnologias proteómicas baseadas em espectrometria de massa permitem agora a análise de alto rendimento, sensível e quantitativa de perfis de expressão proteica a partir de pequenas quantidades de tecido, incluindo amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina (FFPE) rotineiramente recolhidas durante biópsias hepáticas de diagnóstico. Isto permite análises retrospetivas de coortes de doentes bem caracterizadas e facilita a integração de dados proteómicos com resultados clínicos.

Desenho do Estudo e Metodologia Este estudo baseia-se na análise retrospetiva de uma coorte de n=30 doentes do Centro Hospitalar Universitário de Bordéus (CHU), com amostras biológicas e dados clínicos já recolhidos no âmbito dos cuidados de rotina. Uma vez que a transformação maligna da MASLD (Esteatohepatite Associada a Síndrome Metabólica) é um processo longo (vários anos), esta abordagem retrospetiva garante a viabilidade do estudo e a rápida aquisição de resultados.

Para abordar as hipóteses declaradas, este estudo basear-se-á na análise retrospetiva de dados clínicos de doentes da coorte do departamento de hepatologia do CHU de Bordéus (registados sob os identificadores ClinicalTrials.gov NCT01241227 e NCT02060565), bem como na análise proteómica de biópsias hepáticas dos mesmos doentes, disponíveis no Biobanco de Cancro do CHU de Bordéus (CRB). A coorte do CHU de Bordéus inclui atualmente mais de 7000 doentes com MASLD inscritos no diagnóstico e seguidos prospetivamente até à data. O primeiro doente foi incluído em 2003, proporcionando até 20 anos de seguimento para os inscritos inicialmente, tornando esta coorte um recurso valioso para estudar o risco de transformação maligna.

Os dados clínicos foram recolhidos usando um procedimento padronizado dentro de uma base de dados existente, garantindo a qualidade e integridade dos dados para este projeto. Os dados proteómicos de biópsias hepáticas de doentes incluídos no estudo ProteoMASH serão recuperados de uma base de dados dedicada estabelecida no Inserm U1312 e cruzados com dados clínicos da base de dados do CHU (como desenvolvimento de carcinoma hepatocelular [CHC] durante o seguimento, duração do seguimento desde o diagnóstico, presença de diabetes, etc.), visando validar o valor diagnóstico e prognóstico destes novos marcadores biológicos.

Para este estudo, usaremos fragmentos de biópsia obtidos durante os cuidados clínicos de rotina. Os dados clínicos serão extraídos dos registos médicos dos doentes dentro da base de dados do serviço; nenhum procedimento adicional ou consultas de seguimento serão impostos aos doentes, uma vez que os dados de seguimento são recolhidos como parte dos cuidados padrão.

Os doentes da coorte do CHU de Bordéus serão classificados em dois subgrupos:

• Grupo 1 (n=15): doentes com uma biópsia hepática diagnóstica de MASLD antes do desenvolvimento de CHC, com um intervalo de tempo entre a biópsia e o diagnóstico de CHC variando de 1 a 15 anos.
• Grupo 2 (n=15): doentes controlo com uma biópsia hepática diagnóstica de MASLD que não desenvolveram CHC durante o seguimento.

Potenciais vieses inerentes a coortes retrospetivas serão controlados da forma mais eficaz possível:

Os doentes controlo (Grupo 2) serão selecionados tendo em conta fatores de risco conhecidos para CHC, como idade, sexo, presença e controlo da diabetes (definida por HbA1c <8% de acordo com as diretrizes francesas), e estágio de fibrose (definido histologicamente de F0: sem fibrose a F4: cirrose). O objetivo é garantir que estes fatores de risco estejam distribuídos de forma semelhante entre os grupos.

Além disso, garantiremos que os doentes do Grupo 2 tenham sido seguidos durante pelo menos 5 anos com suporte de imagem (ultrassonografia, TAC ou RM) para confirmar que nenhum CHC poderia ter sido perdido.

Para o Grupo 1, serão usados critérios de diagnóstico objetivos para CHC, baseados em imagem (TAC ou RM seguindo os critérios LI-RADS do American College of Radiology) ou histopatologia (nova biópsia ou ressecção cirúrgica), para minimizar o viés de classificação. Além disso, para excluir a possibilidade de CHC oculto no momento da biópsia hepática, apenas serão incluídos doentes com CHC diagnosticado mais de um ano após a biópsia, com imagem (ultrassonografia, TAC ou RM) confirmando ausência de CHC pelo menos um ano após a biópsia e antes do diagnóstico de CHC.

Outro potencial viés relaciona-se com doentes perdidos para seguimento (por exemplo, seguidos noutros centros, falecidos antes dos 15 anos sem desenvolvimento de CHC), que serão excluídos da análise e poderão ter risco diferente de CHC. Portanto, não podemos ter certeza de que os doentes do Grupo 2 representem totalmente todos os doentes com MASLD que não desenvolvem CHC. No entanto, esta limitação é justificada pela natureza exploratória do estudo ProteoMASH e será considerada em projetos futuros.

Além disso, os doentes serão incluídos em períodos de tempo homogéneos para evitar confusão devido a alterações na gestão médica ao longo do tempo.

Finalmente, dados clínicos rotineiramente recolhidos já disponíveis na base de dados existente (por exemplo, valores de HbA1c para controlo da diabetes, estágio de fibrose definido histologicamente) serão usados para minimizar o viés de dados em falta.

As biópsias hepáticas FFPE serão submetidas a fluxos de trabalho proteómicos otimizados e os conjuntos de dados proteómicos resultantes serão analisados usando pipelines bioinformáticos para identificar proteínas ou painéis diferencialmente expressos entre os grupos com e sem CHC. As proteínas identificadas serão anotadas quanto às suas funções biológicas, vias e envolvimento na hepatocarcinogénese.

Implicações Clínicas e de Investigação A identificação de biomarcadores proteómicos robustos para o risco de CHC em doentes com MASH pode ter implicações clínicas profundas. A incorporação de tais biomarcadores nos fluxos de trabalho clínicos poderia refinar algoritmos de estratificação de risco para além do estadiamento da fibrose isoladamente, permitindo cronogramas de vigilância personalizados adaptados aos perfis de risco molecular individuais.

Além disso, biomarcadores proteómicos podem servir como alvos terapêuticos ou indicadores de resposta ao tratamento em intervenções farmacológicas emergentes para MASH e CHC precoce, facilitando abordagens de medicina de precisão.

Estudos futuros devem focar-se na validação destes biomarcadores em coortes maiores e multicêntricas e na integração de dados proteómicos com outras modalidades ómicas (genómica, metabolómica) e parâmetros clínicos. Amostragem longitudinal e análises proteómicas seriadas poderiam elucidar a dinâmica temporal da progressão da doença e flutuações dos biomarcadores.

Conclusão Em conclusão, a aplicação da proteómica tecidual a espécimes de biópsia hepática FFPE de doentes com esteatohepatite associada a síndrome metabólica representa uma estratégia promissora para identificar novos biomarcadores preditivos do risco de carcinoma hepatocelular. Esta abordagem aborda limitações críticas dos métodos de diagnóstico atuais e oferece um caminho para melhor deteção precoce, avaliação de risco personalizada e, em última análise, melhores resultados para os doentes na população crescente afetada pela MASH.