Langzeitvorhersage des MASH-bedingten HCC-Risikos durch Proteomik (PROTEOMASH)

Einführung MASH ist eine fortschreitende Lebererkrankung, die als schwere Form von MASLD anerkannt ist und histologisch durch hepatische Steatose gekennzeichnet ist, die von hepatocellulärer Entzündung und ballonierender Degeneration begleitet wird. Sie stellt ein wachsendes Problem der öffentlichen Gesundheit dar, da sie stark mit Komponenten des metabolischen Syndroms wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz, Typ-2-Diabetes mellitus, Bluthochdruck und Dyslipidämie assoziiert ist. Weltweit wird die Prävalenz von MASLD auf etwa 25 % geschätzt, wobei MASH eine beträchtliche Teilmenge dieser Patienten betrifft, insbesondere solche mit komorbiden Stoffwechselstörungen.

Der Verlauf von MASH ist heterogen und kann zu fortgeschrittener Fibrose, Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) führen. Wichtig ist, dass Zirrhose zwar ein bekannter Risikofaktor für HCC ist, aber neuere epidemiologische und klinische Studien gezeigt haben, dass sich HCC auch in nicht-zirrhotischen Lebern entwickeln kann, die von MASH betroffen sind. Dieses Phänomen erschwert klinische Entscheidungen bezüglich Überwachung und Behandlung, da aktuelle Leitlinien hauptsächlich HCC-Screening bei Patienten mit Zirrhose unabhängig von der Ätiologie empfehlen.

Die Pathogenese von MASH und ihr Fortschreiten zu HCC umfasst komplexe Wechselwirkungen zwischen Stoffwechselstörungen, chronischer hepatischer Entzündung, oxidativem Stress, mitochondrialer Dysfunktion, Lipotoxizität und Aktivierung fibrogener Signalwege. Übermäßige Anhäufung von freien Fettsäuren und toxischen Lipidmetaboliten in Hepatozyten induziert zellulären Stress, der entzündliche Kaskaden und Apoptose auslöst. Kupffer-Zellen und rekrutierte Immunzellen halten das entzündliche Milieu aufrecht und tragen zur fortschreitenden Fibrose bei.

Die zunehmende Inzidenz von MASH-assoziiertem HCC unterstreicht den dringenden Bedarf an neuartigen Biomarkern, die Patienten nach ihrem Risiko für die Entwicklung von HCC genau stratifizieren können. Eine frühzeitige Identifizierung von Hochrisikopersonen würde maßgeschneiderte Überwachungsstrategien, frühzeitige Diagnose und rechtzeitige therapeutische Interventionen ermöglichen, was potenziell die klinischen Ergebnisse verbessern könnte. Leider haben serologische Biomarker, einschließlich Alpha-Fetoprotein (AFP), eine begrenzte Sensitivität und Spezifität für die frühe HCC-Erkennung in der MASH-Population. Daher werden neuartige molekulare Marker, die der zugrunde liegenden Pathophysiologie von MASH und Hepatokarzinogenese entsprechen, aktiv untersucht.

Proteomik, die groß angelegte Untersuchung von Proteinen, die von Zellen oder Geweben exprimiert werden, bietet einzigartige Vorteile für die Biomarker-Entdeckung bei MASH und HCC. Proteine sind die funktionellen Effektoren zellulärer Prozesse und können dynamische pathologische Veränderungen besser widerspiegeln als allein genomische oder transkriptomische Daten.

Die Gewebeproteomik-Profilerstellung durch Massenspektrometrie ist ein innovatives und vielversprechendes Werkzeug, das sich gut für die Identifizierung prognostischer proteomischer Signaturen eignet. Diese Methodik wurde im U1312 BRIC-Labor (Team 3, Leberkrebs und Tumorinvasion) in Zusammenarbeit mit der Oncoprot-Plattform (UMS 005-TBMcore) entwickelt. Ausgehend von einer formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeprobe wird eine Region von Interesse ausgewählt und lasermikrodisseziert. Proteine werden dann extrahiert, die Fixierung wird rückgängig gemacht und Proteine werden mit Trypsin verdaut. Die resultierenden Peptide werden anschließend durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) an einem hochauflösenden Massenspektrometer analysiert. Die Datenverarbeitung wird von einem Bioinformatiker durchgeführt: Jede Probe wird mit einer Referenzprobe (z. B. gesundem Lebergewebe) verglichen, wodurch relative Proteinexpressionintensitäten (Proteinabundanzverhältnisse) berechnet werden können. Zwei Proben können dann mit einer Triangulationsquantifizierungsmethode verglichen werden, die den Vergleich von Proteinabundanzverhältnissen zwischen den Proben beinhaltet. Alle Proteine, die signifikant unterschiedliche Abundanzverhältnisse zwischen den beiden Proben aufweisen, bilden das proteomische Profil.

Fortschritte in massenspektrometriebasierten proteomischen Technologien ermöglichen jetzt einen Hochdurchsatz, eine sensitive und quantitative Analyse von Proteinexpressionprofilen aus kleinen Gewebemengen, einschließlich formalinfixierter paraffineingebetteter (FFPE) Proben, die routinemäßig während diagnostischer Leberbiopsien gesammelt werden. Dies ermöglicht retrospektive Analysen von gut charakterisierten Patienten-Kohorten und erleichtert die Integration proteomischer Daten mit klinischen Ergebnissen.

Studiendesign und Methodik Diese Studie basiert auf der retrospektiven Analyse einer Kohorte von n=30 Patienten des Universitätsklinikums Bordeaux (CHU), bei denen biologische Proben und klinische Daten bereits im Rahmen der Routineversorgung gesammelt wurden. Da die maligne Transformation von MASLD (Metabolic Associated Steatohepatitis) ein langer Prozess ist (mehrere Jahre), stellt dieser retrospektive Ansatz die Durchführbarkeit der Studie und die schnelle Erfassung der Ergebnisse sicher.

Um die genannten Hypothesen zu adressieren, wird sich diese Studie auf die retrospektive Analyse klinischer Daten von Patienten in der Kohorte der Hepatologieabteilung des CHU Bordeaux (registriert unter ClinicalTrials.gov Identifikatoren NCT01241227 und NCT02060565) sowie auf die proteomische Analyse von Leberbiopsien derselben Patienten stützen, die in der CHU Bordeaux Cancer Biobank (CRB) verfügbar sind. Die Bordeaux CHU-Kohorte umfasst derzeit über 7000 MASLD-Patienten, die bei der Diagnose eingeschlossen wurden und bis heute prospektiv nachverfolgt werden. Der erste Patient wurde 2003 eingeschlossen, was für frühe Einschlüsse bis zu 20 Jahre Nachbeobachtung bietet, was diese Kohorte zu einer wertvollen Ressource für die Untersuchung des Risikos einer malignen Transformation macht.

Klinische Daten wurden unter Verwendung eines standardisierten Verfahrens innerhalb einer bestehenden Datenbank gesammelt, was die Datenqualität und Vollständigkeit für dieses Projekt sicherstellt. Proteomische Daten aus Leberbiopsien von Patienten, die in die ProteoMASH-Studie eingeschlossen sind, werden aus einer dedizierten Datenbank abgerufen, die am Inserm U1312 eingerichtet wurde, und mit klinischen Daten aus der CHU-Datenbank (wie Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms [HCC] während der Nachbeobachtung, Dauer der Nachbeobachtung seit Diagnose, Vorhandensein von Diabetes usw.) abgeglichen, um den diagnostischen und prognostischen Wert dieser neuartigen biologischen Marker zu validieren.

Für diese Studie werden wir Biopsiefragmente verwenden, die während der routinemäßigen klinischen Versorgung gewonnen wurden. Klinische Daten werden aus den Patientenakten innerhalb der Dienst-Datenbank extrahiert; es werden keine zusätzlichen Verfahren oder Nachsorgetermine den Patienten auferlegt, da Nachsorgedaten im Rahmen der Standardversorgung gesammelt werden.

Patienten aus der Bordeaux CHU-Kohorte werden in zwei Untergruppen eingeteilt:

• Gruppe 1 (n=15): Patienten mit einer Leberbiopsie, die MASLD diagnostiziert, vor der HCC-Entwicklung, mit einem Zeitintervall zwischen Biopsie und HCC-Diagnose von 1 bis 15 Jahren.
• Gruppe 2 (n=15): Kontrollpatienten mit einer Leberbiopsie, die MASLD diagnostiziert, die während der Nachbeobachtung kein HCC entwickelt haben.

Potenzielle Verzerrungen, die retrospektiven Kohorten inhärent sind, werden so effektiv wie möglich kontrolliert:

Kontrollpatienten (Gruppe 2) werden unter Berücksichtigung bekannter HCC-Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Vorhandensein und Kontrolle von Diabetes (definiert durch HbA1c <8% gemäß französischen Leitlinien) und Fibrosestadium (histologisch definiert von F0: keine Fibrose bis F4: Zirrhose) ausgewählt. Das Ziel ist sicherzustellen, dass diese Risikofaktoren ähnlich zwischen den Gruppen verteilt sind.

Zusätzlich werden wir sicherstellen, dass Gruppe-2-Patienten mindestens 5 Jahre mit bildgebender Unterstützung (Ultraschall, CT oder MRT) nachverfolgt wurden, um zu bestätigen, dass kein HCC übersehen worden sein könnte.

Für Gruppe 1 werden objektive diagnostische Kriterien für HCC verwendet, basierend auf Bildgebung (CT oder MRT nach LI-RADS-Kriterien des American College of Radiology) oder Histopathologie (neue Biopsie oder chirurgische Resektion), um Klassifikationsverzerrungen zu minimieren. Darüber hinaus werden, um die Möglichkeit eines okkulten HCC zum Zeitpunkt der Leberbiopsie auszuschließen, nur Patienten eingeschlossen, bei denen HCC mehr als ein Jahr nach der Biopsie diagnostiziert wurde, wobei Bildgebung (Ultraschall, CT oder MRT) das Fehlen von HCC mindestens ein Jahr nach der Biopsie und vor der HCC-Diagnose bestätigt.

Eine weitere potenzielle Verzerrung betrifft Patienten, die aus der Nachbeobachtung herausgefallen sind (z. B. in anderen Zentren nachverfolgt, vor 15 Jahren ohne HCC-Entwicklung verstorben), die von der Analyse ausgeschlossen werden und möglicherweise ein anderes HCC-Risiko haben. Daher können wir nicht sicher sein, dass Gruppe-2-Patienten alle MASLD-Patienten, die kein HCC entwickeln, vollständig repräsentieren. Diese Einschränkung ist jedoch durch den explorativen Charakter der ProteoMASH-Studie gerechtfertigt und wird in zukünftigen Projekten berücksichtigt.

Darüber hinaus werden Patienten über homogene Zeiträume eingeschlossen, um Verwechslungen aufgrund von Veränderungen im medizinischen Management im Laufe der Zeit zu vermeiden.

Schließlich werden routinemäßig gesammelte klinische Daten, die bereits in der bestehenden Datenbank verfügbar sind (z. B. HbA1c-Werte für die Diabeteskontrolle, histologisch definiertes Fibrosestadium), verwendet, um Verzerrungen durch fehlende Daten zu minimieren.

Leber-FFPE-Biopsien werden optimierten proteomischen Arbeitsabläufen unterzogen, und die resultierenden proteomischen Datensätze werden mit Bioinformatik-Pipelines analysiert, um Proteine oder Panels zu identifizieren, die zwischen den HCC- und Nicht-HCC-Gruppen unterschiedlich exprimiert sind. Identifizierte Proteine werden hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen, Signalwege und Beteiligung an der Hepatokarzinogenese annotiert.

Klinische und Forschungsperspektiven Die Identifizierung robuster proteomischer Biomarker für das HCC-Risiko bei MASH-Patienten kann tiefgreifende klinische Auswirkungen haben. Die Integration solcher Biomarker in klinische Arbeitsabläufe könnte Risikostratifizierungsalgorithmen über die Fibrosestadieneinteilung hinaus verfeinern und ermöglicht personalisierte Überwachungspläne, die auf individuelle molekulare Risikoprofile zugeschnitten sind.

Darüber hinaus können proteomische Biomarker als therapeutische Ziele oder Indikatoren für das Ansprechen auf die Behandlung bei neuartigen pharmakologischen Interventionen für MASH und frühes HCC dienen, was Präzisionsmedizinansätze erleichtert.

Zukünftige Studien sollten sich auf die Validierung dieser Biomarker in größeren, multizentrischen Kohorten und die Integration proteomischer Daten mit anderen Omics-Modalitäten (Genomik, Metabolomik) und klinischen Parametern konzentrieren. Längsschnittliche Probenahmen und serielle proteomische Analysen könnten zeitliche Dynamiken der Krankheitsprogression und Biomarker-Schwankungen aufklären.

Zusammenfassung Zusammenfassend stellt die Anwendung von Gewebeproteomik auf FFPE-Leberbiopsieproben von Patienten mit metabolisch assoziierter Steatohepatitis eine vielversprechende Strategie zur Identifizierung neuartiger Biomarker dar, die das Risiko für ein hepatozelluläres Karzinom vorhersagen. Dieser Ansatz adressiert kritische Einschränkungen aktueller diagnostischer Methoden und bietet einen Weg zu verbesserter Früherkennung, personalisierter Risikobewertung und letztendlich besseren Patienten-Outcomes in der wachsenden Population, die von MASH betroffen ist.