Долгосрочный прогноз риска ГЦК, связанного с МАСЖ, с помощью протеомики (PROTEOMASH)

Введение MASH – это прогрессирующее заболевание печени, признанное тяжелой формой MASLD, характеризующееся гистологически гепатостеатозом в сочетании с воспалением гепатоцитов и баллонной дегенерацией. Оно представляет собой растущую проблему общественного здравоохранения из-за его сильной связи с компонентами метаболического синдрома, такими как ожирение, инсулинорезистентность, сахарный диабет 2 типа, гипертензия и дислипидемия. По всему миру распространенность MASLD оценивается примерно в 25%, при этом MASH поражает значительную часть этих пациентов, особенно тех, у кого есть сопутствующие метаболические нарушения.

Прогрессирование MASH неоднородно и может привести к развитию выраженного фиброза, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Важно отметить, что хотя цирроз является хорошо известным фактором риска ГЦК, недавние эпидемиологические и клинические исследования продемонстрировали, что ГЦК также может развиваться в нецирротической печени, пораженной MASH. Это явление осложняет принятие клинических решений относительно наблюдения и лечения, поскольку текущие рекомендации в основном предлагают скрининг на ГЦК у пациентов с циррозом независимо от этиологии.

Патогенез MASH и его прогрессирование до ГЦК включает сложные взаимодействия между метаболическими нарушениями, хроническим воспалением печени, окислительным стрессом, дисфункцией митохондрий, липотоксичностью и активацией фиброгенных путей. Чрезмерное накопление свободных жирных кислот и токсичных липидных метаболитов в гепатоцитах индуцирует клеточный стресс, запуская воспалительные каскады и апоптоз. Клетки Купфера и рекрутированные иммунные клетки поддерживают воспалительную среду, способствуя прогрессирующему фиброзу.

Увеличивающаяся заболеваемость ГЦК, связанной с MASH, подчеркивает острую необходимость в новых биомаркерах, способных точно стратифицировать пациентов в соответствии с их риском развития ГЦК. Раннее выявление лиц высокого риска позволило бы применять персонализированные стратегии наблюдения, раннюю диагностику и своевременные терапевтические вмешательства, потенциально улучшая клинические исходы. К сожалению, серологические биомаркеры, включая альфа-фетопротеин (АФП), имеют ограниченную чувствительность и специфичность для раннего выявления ГЦК в популяции пациентов с MASH. Таким образом, активно исследуются новые молекулярные маркеры, отражающие лежащую в основе патофизиологию MASH и гепатоканцерогенеза.

Протеомика, масштабное изучение белков, экспрессируемых клетками или тканями, предлагает уникальные преимущества для обнаружения биомаркеров при MASH и ГЦК. Белки являются функциональными эффекторами клеточных процессов и могут лучше отражать динамические патологические изменения по сравнению только с геномными или транскриптомными данными.

Тканевой протеомный профилирование с помощью масс-спектрометрии является инновационным и перспективным инструментом, хорошо подходящим для идентификации прогностических протеомных сигнатур. Эта методология была разработана в лаборатории U1312 BRIC (команда 3, Рак печени и опухолевая инвазия) в сотрудничестве с платформой Oncoprot (UMS 005-TBMcore). Начиная с образца ткани, зафиксированного формалином и залитого в парафин (FFPE), выбирается интересующая область и проводится лазерная микродиссекция. Затем белки экстрагируются, фиксация обращается, и белки подвергаются трипсиновому гидролизу. Полученные пептиды впоследствии анализируются с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) на масс-спектрометре высокого разрешения. Обработка данных выполняется биоинформатиком: каждый образец сравнивается с референсным образцом (например, здоровой тканью печени), что позволяет рассчитать относительные интенсивности экспрессии белков (отношения обилия белков). Затем два образца можно сравнить с использованием метода триангуляционной квантификации, который включает сравнение отношений обилия белков между образцами. Все белки, демонстрирующие статистически значимо различные отношения обилия между двумя образцами, составляют протеомный профиль.

Достижения в протеомных технологиях на основе масс-спектрометрии теперь позволяют проводить высокопроизводительный, чувствительный и количественный анализ профилей экспрессии белков из небольших количеств ткани, включая образцы, зафиксированные формалином и залитые в парафин (FFPE), рутинно собираемые во время диагностических биопсий печени. Это позволяет проводить ретроспективный анализ хорошо охарактеризованных когорт пациентов и облегчает интеграцию протеомных данных с клиническими исходами.

Дизайн исследования и методология Это исследование основано на ретроспективном анализе когорты из n=30 пациентов из Университетской больницы Бордо (CHU), у которых биологические образцы и клинические данные уже были собраны в рамках рутинного лечения. Поскольку злокачественная трансформация MASLD (Метаболический ассоциированный стеатогепатит) – это длительный процесс (несколько лет), этот ретроспективный подход обеспечивает выполнимость исследования и быстрое получение результатов.

Для проверки заявленных гипотез это исследование будет опираться на ретроспективный анализ клинических данных пациентов из когорты отделения гепатологии CHU Бордо (зарегистрированных под идентификаторами ClinicalTrials.gov NCT01241227 и NCT02060565), а также на протеомный анализ биопсий печени тех же пациентов, доступных в Биобанке рака CHU Бордо (CRB). Когорта CHU Бордо в настоящее время включает более 7000 пациентов с MASLD, включенных при постановке диагноза и проспективно наблюдаемых на сегодняшний день. Первый пациент был включен в 2003 году, что обеспечивает до 20 лет наблюдения для ранних участников, делая эту когорту ценным ресурсом для изучения риска злокачественной трансформации.

Клинические данные собирались с использованием стандартизированной процедуры в рамках существующей базы данных, что обеспечивает качество и полноту данных для этого проекта. Протеомные данные из биопсий печени пациентов, включенных в исследование ProteoMASH, будут извлечены из специальной базы данных, созданной в Inserm U1312, и сопоставлены с клиническими данными из базы данных CHU (такими как развитие гепатоцеллюлярной карциномы [ГЦК] во время наблюдения, продолжительность наблюдения с момента постановки диагноза, наличие диабета и т.д.), с целью валидации диагностической и прогностической ценности этих новых биологических маркеров.

Для этого исследования мы будем использовать фрагменты биопсий, полученные в ходе рутинного клинического лечения. Клинические данные будут извлечены из медицинских карт пациентов в базе данных службы; никаких дополнительных процедур или визитов для наблюдения не будет налагаться на пациентов, поскольку данные наблюдения собираются в рамках стандартного лечения.

Пациенты из когорты CHU Бордо будут классифицированы на две подгруппы:

• Группа 1 (n=15): пациенты с диагностической биопсией печени, подтверждающей MASLD до развития ГЦК, с интервалом времени между биопсией и диагнозом ГЦК от 1 до 15 лет.
• Группа 2 (n=15): контрольные пациенты с диагностической биопсией печени, подтверждающей MASLD, у которых ГЦК не развилась во время наблюдения.

Потенциальные систематические ошибки, присущие ретроспективным когортам, будут контролироваться максимально эффективно:

Контрольные пациенты (Группа 2) будут отбираться с учетом известных факторов риска ГЦК, таких как возраст, пол, наличие и контроль диабета (определяемого по HbA1c <8% согласно французским рекомендациям) и стадия фиброза (гистологически определяемая от F0: отсутствие фиброза до F4: цирроз). Цель – обеспечить схожее распределение этих факторов риска между группами.

Кроме того, мы обеспечим, чтобы пациенты Группы 2 наблюдались не менее 5 лет с визуализационной поддержкой (УЗИ, КТ или МРТ) для подтверждения, что никакая ГЦК не могла быть пропущена.

Для Группы 1 будут использоваться объективные диагностические критерии ГЦК, основанные на визуализации (КТ или МРТ по критериям LI-RADS Американского колледжа радиологии) или гистопатологии (новая биопсия или хирургическая резекция), чтобы минимизировать классификационную ошибку. Кроме того, чтобы исключить возможность скрытой ГЦК на момент биопсии печени, будут включены только пациенты с диагнозом ГЦК, поставленным более чем через год после биопсии, при этом визуализация (УЗИ, КТ или МРТ) должна подтверждать отсутствие ГЦК как минимум через год после биопсии и до постановки диагноза ГЦК.

Еще одна потенциальная ошибка связана с пациентами, потерянными для наблюдения (например, наблюдаемыми в других центрах, умершими до 15 лет без развития ГЦК), которые будут исключены из анализа и могут иметь иной риск ГЦК. Следовательно, мы не можем быть уверены, что пациенты Группы 2 полностью представляют всех пациентов с MASLD, у которых не развивается ГЦК. Однако это ограничение оправдано поисковым характером исследования ProteoMASH и будет учтено в будущих проектах.

Более того, пациенты будут включаться в однородные временные периоды, чтобы избежать смешения из-за изменений в медицинском ведении с течением времени.

Наконец, рутинно собранные клинические данные, уже доступные в существующей базе данных (например, значения HbA1c для контроля диабета, гистологически определенная стадия фиброза), будут использоваться для минимизации ошибки, связанной с отсутствием данных.

FFPE-биопсии печени пройдут оптимизированные протеомные процедуры, и полученные протеомные наборы данных будут проанализированы с использованием биоинформатических конвейеров для идентификации белков или панелей, дифференциально экспрессируемых между группами с ГЦК и без ГЦК. Идентифицированные белки будут аннотированы по их биологическим функциям, путям и вовлеченности в гепатоканцерогенез.

Клинические и исследовательские последствия Идентификация надежных протеомных биомаркеров риска ГЦК у пациентов с MASH может иметь глубокие клинические последствия. Включение таких биомаркеров в клиническую практику может усовершенствовать алгоритмы стратификации риска, выходящие за рамки только стадирования фиброза, позволяя персонализировать графики наблюдения в соответствии с индивидуальными молекулярными профилями риска.

Более того, протеомные биомаркеры могут служить терапевтическими мишенями или индикаторами ответа на лечение в новых фармакологических вмешательствах при MASH и ранней ГЦК, способствуя подходам прецизионной медицины.

Будущие исследования должны быть сосредоточены на валидации этих биомаркеров в более крупных, многоцентровых когортах и интеграции протеомных данных с другими омиксными модальностями (геномика, метаболомика) и клиническими параметрами. Лонгитюдный отбор проб и серийные протеомные анализы могли бы прояснить временную динамику прогрессирования заболевания и колебаний биомаркеров.

Заключение В заключение, применение тканевой протеомики к FFPE-образцам биопсий печени пациентов с метаболическим ассоциированным стеатогепатитом представляет собой многообещающую стратегию для идентификации новых биомаркеров, предиктивных риска гепатоцеллюлярной карциномы. Этот подход решает критические ограничения текущих диагностических методов и предлагает путь к улучшенному раннему выявлению, персонализированной оценке риска и, в конечном итоге, лучшим исходам для пациентов в растущей популяции, пораженной MASH.