단백체학을 통한 MASH 관련 HCC 위험의 장기 예측 (PROTEOMASH)

MASH는 진행성 간 질환으로, 조직학적으로 지방간증에 간세포 염증 및 풍선 변성이 동반되는 MASLD의 중증 형태로 인식됩니다. 비만, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고혈압 및 이상지질혈증과 같은 대사 증후군 구성요소들과의 강한 연관성으로 인해 이는 증가하는 공중 보건 문제를 나타냅니다. 전 세계적으로 MASLD 유병률은 약 25%로 추정되며, MASH는 특히 동반 대사 장애가 있는 환자들을 포함하여 이러한 환자들의 상당 부분에 영향을 미칩니다.

MASH 진행은 이질적이며 진행성 섬유증, 간경변증 및 간세포암종(HCC)으로 이어질 수 있습니다. 중요하게도, 간경변증은 HCC의 잘 알려진 위험 인자이지만, 최근 역학 및 임상 연구들은 HCC가 MASH로 영향을 받은 비간경변 간에서도 발생할 수 있음을 입증했습니다. 이 현상은 현재 지침이 원인에 관계없이 간경변증 환자에서 HCC 선별 검사를 주로 권장하기 때문에 감시 및 관리에 관한 임상적 의사 결정을 복잡하게 만듭니다.

MASH의 발병 기전 및 HCC로의 진행은 대사 장애, 만성 간 염증, 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, 지질 독성 및 섬유화 경로의 활성화 사이의 복잡한 상호작용을 포함합니다. 간세포 내 유리 지방산 및 독성 지질 대사물의 과도한 축적은 세포 스트레스를 유발하여 염증 연쇄 반응 및 세포 사멸을 유도합니다. 쿠퍼 세포 및 모집된 면역 세포들은 염증 환경을 지속시켜 진행성 섬유화에 기여합니다.

MASH 관련 HCC의 증가하는 발생률은 HCC 발병 위험에 따라 환자들을 정확하게 계층화할 수 있는 새로운 생체 표지자들의 긴급한 필요성을 강조합니다. 고위험 개인들의 조기 식별은 맞춤형 감시 전략, 조기 진단 및 시기적절한 치료적 개입을 가능하게 하여 잠재적으로 임상 결과를 개선할 수 있습니다. 불행히도, 알파-태아단백질(AFP)을 포함한 혈청학적 생체 표지자들은 MASH 인구에서 조기 HCC 탐지를 위한 제한된 민감도 및 특이도를 가집니다. 따라서, MASH 및 간암 발생의 기저 병태생리를 반영하는 새로운 분자 표지자들이 적극적으로 연구되고 있습니다.

단백질체학, 즉 세포나 조직에 의해 발현되는 단백질들의 대규모 연구는 MASH 및 HCC에서 생체 표지자 발견을 위한 독특한 장점을 제공합니다. 단백질들은 세포 과정들의 기능적 효과자들이며, 유전체 또는 전사체 데이터만으로는 반영하기 어려운 역동적인 병리학적 변화들을 더 잘 반영할 수 있습니다.

질량 분석법에 의한 조직 단백질체 프로파일링은 예후 단백질체 서명 식별에 적합한 혁신적이고 유망한 도구입니다. 이 방법론은 Oncoprot 플랫폼(UMS 005-TBMcore)과 협력하여 U1312 BRIC 연구실(팀 3, 간암 및 종양 침습)에서 개발되었습니다. 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 샘플로 시작하여 관심 영역을 선택하고 레이저 미세 절제합니다. 그런 다음 단백질을 추출하고 고정을 역전시키며 트립신을 사용하여 단백질을 소화합니다. 생성된 펩타이드들은 고해상도 질량 분석기에서 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 분석됩니다. 데이터 처리는 생물정보학자에 의해 수행됩니다: 각 샘플은 기준 샘플(예: 건강한 간 조직)과 비교되어 상대적 단백질 발현 강도(단백질 풍부도 비율)를 계산할 수 있습니다. 그런 다음 두 샘플을 삼각 측량 정량 방법을 사용하여 비교할 수 있으며, 이는 샘플 간 단백질 풍부도 비율을 비교하는 것을 포함합니다. 두 샘플 간에 유의하게 다른 풍부도 비율을 보이는 모든 단백질들이 단백질체 프로필을 구성합니다.

질량 분석 기반 단백질체 기술의 발전은 이제 진단적 간 생검 중에 일상적으로 수집되는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플을 포함한 소량의 조직으로부터 단백질 발현 프로필의 고처리량, 민감 및 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이것은 잘 특징화된 환자 코호트의 후향적 분석을 허용하고 단백질체 데이터를 임상 결과와 통합하는 것을 용이하게 합니다.

연구 설계 및 방법론 이 연구는 보르도 대학 병원(CHU)의 n=30명 환자 코호트의 후향적 분석을 기반으로 하며, 생물학적 샘플 및 임상 데이터는 이미 일상적 치료의 일부로 수집되었습니다. MASLD(대사 연관 지방간염)의 악성 변이는 긴 과정(수년)이기 때문에, 이 후향적 접근은 연구의 실행 가능성과 결과의 신속한 획득을 보장합니다.

명시된 가설들을 해결하기 위해, 이 연구는 CHU 보르도 간학과 코호트 환자들의 임상 데이터(ClinicalTrials.gov 식별자 NCT01241227 및 NCT02060565로 등록됨)의 후향적 분석과 동일한 환자들의 간 생검의 단백질체 분석에 의존할 것이며, 이는 CHU 보르도 암 바이오뱅크(CRB)에서 이용 가능합니다. 보르도 CHU 코호트는 현재 진단 시 등록되고 현재까지 전향적으로 추적 관찰된 7000명 이상의 MASLD 환자들을 포함합니다. 첫 번째 환자는 2003년에 포함되어 초기 등록자들에게 최대 20년의 추적 관찰을 제공하므로, 이 코호트는 악성 변이 위험 연구를 위한 귀중한 자원입니다.

임상 데이터는 기존 데이터베이스 내에서 표준화된 절차를 사용하여 수집되었으며, 이 프로젝트를 위한 데이터 품질과 완전성을 보장합니다. ProteoMASH 연구에 포함된 환자들의 간 생검 단백질체 데이터는 Inserm U1312에 설립된 전용 데이터베이스에서 검색되고 CHU 데이터베이스의 임상 데이터(예: 추적 관찰 중 간세포암종[HCC] 발달, 진단 이후 추적 관찰 기간, 당뇨병 존재 여부 등)와 교차 참조되어 이러한 새로운 생물학적 표지자들의 진단 및 예후적 가치를 검증하는 것을 목표로 합니다.

이 연구를 위해, 우리는 일상적 임상 치료 중에 얻어진 생검 조각들을 사용할 것입니다. 임상 데이터는 서비스 데이터베이스 내 환자 의료 기록에서 추출될 것입니다; 추적 관찰 데이터는 표준 치료의 일부로 수집되기 때문에 환자들에게 추가 절차나 추적 관찰 방문이 부과되지 않을 것입니다.

보르도 CHU 코호트의 환자들은 두 하위 그룹으로 분류될 것입니다:

• 그룹 1 (n=15): HCC 발병 전 MASLD 진단을 위한 간 생검을 받은 환자들로, 생검과 HCC 진단 사이의 시간 간격이 1년에서 15년 사이입니다.
• 그룹 2 (n=15): 추적 관찰 중 HCC를 발병하지 않은 MASLD 진단을 위한 간 생검을 받은 대조군 환자들.

후향적 코호트에 내재된 잠재적 편향은 가능한 한 효과적으로 통제될 것입니다:

대조군 환자들(그룹 2)은 연령, 성별, 당뇨병의 존재 및 통제(프랑스 지침에 따라 HbA1c <8%로 정의됨), 그리고 섬유화 단계(조직학적으로 F0: 섬유화 없음에서 F4: 간경변증까지 정의됨)와 같은 알려진 HCC 위험 인자들을 고려하여 선택될 것입니다. 목표는 이러한 위험 인자들이 그룹 간에 유사하게 분포되도록 보장하는 것입니다.

또한, 우리는 그룹 2 환자들이 최소 5년 동안 영상 지원(초음파, CT 스캔 또는 MRI)으로 추적 관찰되었음을 보장하여 HCC가 놓칠 수 없었음을 확인할 것입니다.

그룹 1의 경우, 분류 편향을 최소화하기 위해 영상(미국 방사선 대학의 LI-RADS 기준에 따른 CT 또는 MRI) 또는 조직병리학(새 생검 또는 외과적 절제)을 기반으로 한 HCC의 객관적 진단 기준이 사용될 것입니다. 또한, 간 생검 시 잠재적 HCC 가능성을 배제하기 위해, 생검 후 1년 이상 경과한 후에 HCC 진단을 받은 환자들만 포함될 것이며, 영상(초음파, CT 또는 MRI)이 생검 후 최소 1년 후 및 HCC 진단 전에 HCC 부재를 확인할 것입니다.

또 다른 잠재적 편향은 추적 관찰이 중단된 환자들(예: 다른 센터에서 추적 관찰, HCC 발병 없이 15년 전 사망)과 관련되며, 이들은 분석에서 제외되고 다른 HCC 위험을 가질 수 있습니다. 따라서, 우리는 그룹 2 환자들이 HCC를 발병하지 않는 모든 MASLD 환자들을 완전히 대표한다고 확신할 수 없습니다. 그러나, 이 제한은 ProteoMASH 연구의 탐색적 성격으로 정당화되며 향후 프로젝트에서 고려될 것입니다.

또한, 환자들은 시간에 따른 의료 관리 변화로 인한 교란을 피하기 위해 균질한 기간에 걸쳐 포함될 것입니다.

마지막으로, 기존 데이터베이스에서 이미 이용 가능한 일상적으로 수집된 임상 데이터(예: 당뇨병 통제를 위한 HbA1c 값, 조직학적으로 정의된 섬유화 단계)가 누락 데이터 편향을 최소화하기 위해 사용될 것입니다.

간 FFPE 생검들은 최적화된 단백질체 워크플로우를 거치고 생성된 단백질체 데이터셋들은 생물정보학 파이프라인을 사용하여 분석되어 HCC 및 비-HCC 그룹 간에 차등 발현된 단백질들 또는 패널들을 식별할 것입니다. 식별된 단백질들은 그들의 생물학적 기능, 경로 및 간암 발생 관련성에 대해 주석이 달릴 것입니다.

임상 및 연구적 함의 MASH 환자들의 HCC 위험에 대한 강력한 단백질체 생체 표지자들의 식별은 심오한 임상적 함의를 가질 수 있습니다. 이러한 생체 표지자들을 임상 워크플로우에 통합하는 것은 섬유화 단계 분류만을 넘어서는 위험 계층화 알고리즘을 정제하여 개별 분자 위험 프로필에 맞춤형 감시 일정을 가능하게 할 수 있습니다.

더욱이, 단백질체 생체 표지자들은 MASH 및 조기 HCC에 대한 신약 약리적 개입에서 치료 표적이나 치료 반응 지표로 역할할 수 있으며, 정밀 의학 접근법을 용이하게 할 수 있습니다.

향후 연구는 더 큰 다기관 코호트에서 이러한 생체 표지자들을 검증하고 단백질체 데이터를 다른 오믹스 양식(유전체학, 대사체학) 및 임상 매개변수들과 통합하는 데 초점을 맞추어야 합니다. 종단 샘플링 및 연속 단백질체 분석은 질병 진행 및 생체 표지자 변동의 시간적 역학을 밝힐 수 있습니다.

결론 결론적으로, 대사 연관 지방간염 환자들의 FFPE 간 생검 표본에 조직 단백질체학을 적용하는 것은 간세포암종 위험을 예측하는 새로운 생체 표지자들을 식별하기 위한 유망한 전략을 나타냅니다. 이 접근법은 현재 진단 방법들의 중요한 한계를 해결하고 MASH로 영향을 받는 증가하는 인구에서 개선된 조기 탐지, 맞춤형 위험 평가 및 궁극적으로 더 나은 환자 결과를 향한 길을 제공합니다.