Proteomiikkaan perustuva MASH-liittyvän HCC-riskin pitkän aikavälin ennustaminen (PROTEOMASH)

Johdanto MASH on etenevä maksasairaus, joka tunnistetaan MASLD:n vakavana muotona ja jolle on histologisesti ominaista maksan rasvoittuminen sekä maksasolujen tulehdus ja pallolaajentumisen degeneraatio. Se on kasvava kansanterveydellinen huolenaihe sen vahvan yhteyden vuoksi metabolisen oireyhtymän komponentteihin, kuten lihavuuteen, insuliiniresistenssiin, tyypin 2 diabetes mellitusiin, verenpaineen kohoamiseen ja dyslipidemiaan. Maailmanlaajuisesti MASLD:n esiintyvyys on arviolta noin 25 %, ja MASH vaikuttaa merkittävään osaan näistä potilaista, erityisesti niillä, joilla on samanaikaisia metabolisia häiriöitä.

MASH:n eteneminen on heterogeenistä ja voi johtaa edistyneeseen fibroosiin, kirssoon ja maksasyöpään (HCC). Tärkeää on, että vaikka kirsso on tunnettu riskitekijä HCC:lle, viimeaikaiset epidemiologiset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että HCC voi kehittyä myös ei-kirsoisissa maksissa, joihin MASH on vaikuttanut. Tämä ilmiö monimutkaistaa kliinistä päätöksentekoa seurannan ja hoidon suhteen, koska nykyiset suositukset suosittelevat pääasiassa HCC:n seulontaa potilaille, joilla on kirsso riippumatta etiologiasta.

MASH:n patogeneesi ja sen eteneminen HCC:ksi käsittää monimutkaisia vuorovaikutuksia metabolisten häiriöiden, kroonisen maksatulehduksen, oksidatiivisen stressin, mitokondriotoimintahäiriöiden, lipotoksisuuden ja fibrogeenisten reittien aktivoitumisen välillä. Liiallinen vapaan rasvahappojen ja myrkyllisten lipidimetaboliittien kertyminen maksasoluissa aiheuttaa solustressiä, laukaisten tulehdusreaktioita ja apoptosia. Kupffer-solut ja rekrytoidut immuunisolut ylläpitävät tulehdusympäristöä, edistäen etenevää fibroosia.

Kasvava MASH-liittyvän HCC:n ilmaantuvuus korostaa kiireellistä tarvetta uusille biomarkkereille, jotka pystyvät luokittelemaan potilaat tarkasti heidän HCC-riskinsä mukaan. Korkean riskin yksilöiden varhainen tunnistaminen mahdollistaisi räätälöidyt seurantastrategiat, varhaisen diagnoosin ja ajalliset terapiasuunnitelmat, mahdollisesti parantaen kliinisiä tuloksia. Valitettavasti serologiset biomarkkerit, mukaan lukien alfa-fetoproteiini (AFP), ovat rajallisen herkkiä ja spesifisiä varhaisen HCC:n havaitsemisessa MASH-väestössä. Siksi uusia molekyylimerkkejä, jotka heijastavat MASH:n ja maksasyöpäprosessin taustalla olevaa patofysiologiaa, tutkitaan aktiivisesti.

Proteomiikka, solujen tai kudosten tuottamien proteiinien laajamittainen tutkimus, tarjoaa ainutlaatuisia etuja biomarkkerien löytämisessä MASH:ssa ja HCC:ssä. Proteiinit ovat solujen toiminnallisia vaikuttajia ja voivat paremmin heijastaa dynaamisia patologisia muutoksia verrattuna pelkästään genomiikkaan tai transkriptomiikkaan.

Kudoksen proteomin profiloiminen massaspektrometrian avulla on innovatiivinen ja lupaava työkalu, joka soveltuu hyvin ennusteellisten proteomisten signatuurien tunnistamiseen. Tämä metodologia kehitettiin U1312 BRIC-laboratoriossa (tiimi 3, Liver Cancers and Tumor Invasion) yhteistyössä Oncoprot-alustan (UMS 005-TBMcore) kanssa. Aloittaen formaldehydiin kiinnitetystä, parafiiniin upotetusta (FFPE) kudosnäytteestä, valitaan kiinnostuksen kohde ja se leikataan laser-mikrodissektiolla. Proteiinit poistetaan sitten, kiinnitys kumotaan ja proteiinit pilkotaan trypsiinillä. Syntyneet peptidit analysoidaan sitten nestekromatografia-tandem-massaspektrometriala (LC-MS/MS) korkearesoluutioisella massaspektrometrillä. Tiedonkäsittely suoritetaan bioinformaatikkon toimesta: jokainen näyte verrataan vertailunäytteeseen (esim. terve maksakudos), mikä mahdollistaa suhteellisten proteiiniekspressiointensiteettien (proteiinien runsaussuhde) laskemisen. Kahta näytettä voidaan sitten verrata triangulaatiokvantifiointimenetelmällä, joka sisältää proteiinien runsaussuhde-vertailun näytteiden välillä. Kaikki proteiinit, jotka osoittavat merkitsevästi erilaisia runsaussuhdeita kahden näytteen välillä, muodostavat proteomin profiilin.

Massaspektrometriaan perustuvien proteomisten teknologioiden edistysaskeleet mahdollistavat nyt suurtehokkaan, herkän ja kvantitatiivisen analyysin proteiiniekspressioprofiileista pienistä kudosmääristä, mukaan lukien formaaliin-kiinnitetyistä parafiiniin-upotetuista (FFPE) näytteistä, joita kerätään säännöllisesti diagnoosimaksabiopsioiden aikana. Tämä mahdollistaa hyvin karakterisoitujen potilaskohorttien retrospektiiviset analyysit ja helpottaa proteomitietojen integrointia kliinisiin tuloksiin.

Tutkimussuunnittelu ja metodologia Tämä tutkimus perustuu retrospektiiviseen analyysiin n=30 potilaan kohortista Bordeaux'n yliopistollisesta sairaalasta (CHU), jossa biologisten näytteiden ja kliinisten tietojen kerääminen on jo tapahtunut rutiinihoidon osana. Koska MASLD:n (Metabolic Associated Steatohepatitis) pahanlaatuinen muuntuminen on pitkä prosessi (useita vuosia), tämä retrospektiivinen lähestymistapa varmistaa tutkimuksen toteutettavuuden ja tulosten nopean hankinnan.

Esitettyjen hypoteesien käsittelemiseksi tämä tutkimus nojautuu retrospektiiviseen analyysiin potilaiden kliinisistä tiedoista Bordeaux'n CHU:n hepatologiaosaston kohortissa (rekisteröity ClinicalTrials.gov-tunnuksilla NCT01241227 ja NCT02060565), sekä proteomiikan analyysiin samojen potilaiden maksabiopsioista, jotka ovat saatavilla Bordeaux'n CHU:n syöpäbiopankissa (CRB). Bordeaux'n CHU-kohortti sisältää tällä hetkellä yli 7000 MASLD-potilasta, jotka on rekisteröity diagnoosivaiheessa ja seurattu prospektiivisesti tähän päivään asti. Ensimmäinen potilas sisällytettiin vuonna 2003, mikä tarjoaa jopa 20 vuoden seuranta-ajan varhaisille osallistujille, tehden tästä kohortista arvokkaan resurssin pahanlaatuisen muuntumisen riskin tutkimiseen.

Kliininen data on kerätty standardoidulla menettelyllä olemassa olevaan tietokantaan, varmistaen tietojen laadun ja täydellisyyden tätä projektia varten. Proteomitiedot ProteoMASH-tutkimukseen sisällytettyjen potilaiden maksabiopsioista noudetaan Inserm U1312:ssa perustetusta erityistietokannasta ja ristiviitataan CHU-tietokannan kliinisiin tietoihin (kuten maksasyövän [HCC] kehittyminen seurannan aikana, seurannan kesto diagnoosista lähtien, diabeteksen esiintyminen jne.), tavoitteena validoida näiden uusien biologisten markkereiden diagnostinen ja ennusteellinen arvo.

Tässä tutkimuksessa käytämme biopsiafragmenteja, jotka on saatu rutiinikliinisen hoidon aikana. Kliininen data poimitaan potilaan sairauskertomuksista palvelun tietokannasta; potilaille ei määrätä lisätoimenpiteitä tai seurantakäyntejä, koska seurantatiedot kerätään osana standardihoidon toimenpiteitä.

Bordeaux'n CHU-kohortin potilaat luokitellaan kahteen alaryhmään:

• Ryhmä 1 (n=15): potilaat, joilla on maksabiopsia, joka diagnosoi MASLD:n ennen HCC:n kehittymistä, ja biopsian ja HCC-diagnoosin välinen aikaväli on 1–15 vuotta.
• Ryhmä 2 (n=15): kontrollipotilaat, joilla on maksabiopsia, joka diagnosoi MASLD:n, ja jotka eivät kehittäneet HCC:ta seurannan aikana.

Retrospektiivisiin kohortteihin liittyvät mahdolliset harhat pyritään hallitsemaan mahdollisimman tehokkaasti:

Kontrollipotilaat (Ryhmä 2) valitaan ottaen huomioon tunnetut HCC-riskitekijät, kuten ikä, sukupuoli, diabeteksen esiintyminen ja hallinta (määritelty HbA1c <8 % ranskalaisten suositusten mukaan) sekä fibroosivaihe (histologisesti määritelty F0: ei fibroosia - F4: kirsso). Tavoitteena on varmistaa, että nämä riskitekijät jakautuvat samankaltaisesti ryhmien välillä.

Lisäksi varmistamme, että Ryhmän 2 potilaita on seurattu vähintään 5 vuotta kuvantamistuen avulla (ultraääni, CT- tai MRI-kuvaus) vahvistaaksemme, ettei HCC:ta olisi voitu jättää huomaamatta.

Ryhmälle 1 käytetään objektiivisia HCC-diagnoosikriteerejä, jotka perustuvat kuvantamiseen (CT tai MRI American College of Radiologyn LI-RADS-kriteerien mukaan) tai histopatologiaan (uusi biopsia tai kirurginen resektio), minimoidaksemme luokitteluharhan. Lisäksi, jotta voidaan sulkea pois mahdollisuus piilevään HCC:hen maksabiopsian aikaan, vain potilaat, joilla HCC on diagnosoitu yli vuosi biopsian jälkeen, sisällytetään, ja kuvantamisella (ultraääni, CT tai MRI) varmistetaan HCC:n puuttuminen vähintään vuosi biopsian jälkeen ja ennen HCC-diagnoosia.

Toinen mahdollinen harha liittyy potilaisiin, jotka ovat kadonneet seurannasta (esim. seurattu muissa keskuksissa, kuollut ennen 15 vuotta ilman HCC:n kehittymistä), jotka jätetään analyysin ulkopuolelle ja joilla saattaa olla erilainen HCC-riski. Siksi emme voi olla varmoja, että Ryhmän 2 potilaat edustavat täysin kaikkia MASLD-potilaita, jotka eivät kehitä HCC:ta. Tämä rajoitus on kuitenkin perusteltu ProteoMASH-tutkimuksen luonteella ja otetaan huomioon tulevissa projekteissa.

Lisäksi potilaat sisällytetään homogeenisten ajanjaksojen aikana välttääksemme sekoittumisen lääketieteellisen hoidon muutosten vuoksi ajan myötä.

Lopuksi rutiininomaisesti kerättyjä kliinisiä tietoja, jotka ovat jo saatavilla olemassa olevassa tietokannassa (esim. HbA1c-arvot diabeteksen hallintaan, histologisesti määritelty fibroosivaihe), käytetään minimoidaksemme puuttuvien tietojen harhaa.

Maksan FFPE-biopsiat käsitellään optimoiduilla proteomisilla työnkuluilla ja syntyneitä proteomisia tietoaineistoja analysoidaan bioinformatiikan putkistoilla tunnistaaksemme proteiinit tai paneelit, jotka ilmentyvät eri tavoin HCC- ja ei-HCC-ryhmien välillä. Tunnistetut proteiinit annotoidaan niiden biologisten toimintojen, reittien ja osallistumisen maksasyöpäprosessiin perusteella.

Kliiniset ja tutkimukselliset vaikutukset Vankkojen proteomisten biomarkkereiden tunnistaminen HCC-riskiin MASH-potilailla voi olla syvällisiä kliinisiä vaikutuksia. Tällaisten biomarkkereiden sisällyttäminen kliinisiin työnkuluihin voisi tarkentaa riskiluokittelualgoritmeja pelkän fibroosivaiheen ulkopuolella, mahdollistaen henkilökohtaiset seuranta-aikataulut, jotka on räätälöity yksilöllisten molekyyliriskiprofiilien mukaan.

Lisäksi proteomiset biomarkkerit voivat toimia terapeuttisina kohteina tai hoidon vastauksen indikaattoreina MASH:n ja varhaisen HCC:n kehittyvissä farmakologisissa interventioissa, helpottaen täsmälääketieteen lähestymistapoja.

Tulevien tutkimusten tulisi keskittyä näiden biomarkkereiden validoimiseen suuremmissa, monikeskustutkimuksissa ja proteomitietojen integroimiseen muihin omiikkamuotoihin (genomiikka, metabolomiikka) ja kliinisiin parametreihin. Pitkittäisnäytteenotto ja sarjalliset proteomiset analyysit voisivat valaista sairauden etenemisen ajallista dynamiikkaa ja biomarkkerien vaihteluita.

Johtopäätös Yhteenvetona kudoksen proteomiikan soveltaminen formaaliin-kiinnitettyihin parafiiniin-upotettuihin maksabiopsianäytteisiin metabolisen oireyhtymään liittyvän steatohepatitiisin potilailta edustaa lupaavaa strategiaa uusien maksasyövän riskiä ennustavien biomarkkereiden tunnistamiseksi. Tämä lähestymistapa käsittelee nykyisten diagnostisten menetelmien kriittisiä rajoituksia ja tarjoaa tien kohti parannettua varhaista havaitsemista, henkilökohtaista riskinarviointia ja lopulta parempia potilastuloksia kasvavassa MASH:sta kärsivässä väestössä.