Langetermijnvoorspelling van MASH-gerelateerd HCC-risico door proteomics (PROTEOMASH)

Introductie MASH is een progressieve leverziekte, erkend als een ernstige vorm van MASLD, gekenmerkt door histologische leververvetting gepaard gaande met hepatocellulaire ontsteking en ballonvormige degeneratie. Het vormt een groeiend probleem voor de volksgezondheid vanwege de sterke associatie met componenten van het metabool syndroom zoals obesitas, insulineresistentie, diabetes mellitus type 2, hypertensie en dyslipidemie. Wereldwijd wordt de prevalentie van MASLD geschat op ongeveer 25%, waarbij MASH een aanzienlijke subset van deze patiënten treft, met name diegenen met comorbiditeiten van metabole stoornissen.

De progressie van MASH is heterogeen en kan leiden tot gevorderde fibrose, cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC). Belangrijk is dat, hoewel cirrose een bekende risicofactor voor HCC is, recente epidemiologische en klinische studies hebben aangetoond dat HCC zich ook kan ontwikkelen in niet-cirrotische levers aangetast door MASH. Dit fenomeen compliceert de klinische besluitvorming met betrekking tot surveillance en behandeling, aangezien huidige richtlijnen primair HCC-screening aanbevelen bij patiënten met cirrose, ongeacht de etiologie.

De pathogenese van MASH en de progressie naar HCC omvat complexe interacties tussen metabole ontregelingen, chronische hepatische ontsteking, oxidatieve stress, mitochondriale dysfunctie, lipotoxiciteit en activering van fibrogene routes. Overmatige ophoping van vrije vetzuren en toxische lipidenmetabolieten in hepatocyten induceert cellulaire stress, wat inflammatoire cascades en apoptose triggert. Kupffer-cellen en gerekruteerde immuuncellen bestendigen de inflammatoire omgeving, wat bijdraagt aan progressieve fibrose.

De toenemende incidentie van MASH-gerelateerd HCC benadrukt de dringende behoefte aan nieuwe biomarkers die patiënten nauwkeurig kunnen stratificeren volgens hun risico op HCC-ontwikkeling. Vroege identificatie van hoogrisico-individuen zou op maat gemaakte surveillance-strategieën, vroege diagnose en tijdige therapeutische interventies mogelijk maken, wat mogelijk de klinische uitkomsten verbetert. Helaas hebben serologische biomarkers, waaronder alfa-fetoproteïne (AFP), beperkte gevoeligheid en specificiteit voor vroege HCC-detectie in de MASH-populatie. Daarom worden nieuwe moleculaire markers die de onderliggende pathofysiologie van MASH en hepatocarcinogenese weerspiegelen actief onderzocht.

Proteomica, de grootschalige studie van eiwitten die door cellen of weefsels worden uitgedrukt, biedt unieke voordelen voor biomarker-ontdekking in MASH en HCC. Eiwitten zijn de functionele effectoren van cellulaire processen en kunnen dynamische pathologische veranderingen beter weerspiegelen in vergelijking met alleen genomische of transcriptomische data.

Weefselproteomische profilering door middel van massaspectrometrie is een innovatief en veelbelovend instrument dat goed geschikt is voor de identificatie van prognostische proteomische handtekeningen. Deze methodologie is ontwikkeld in het U1312 BRIC-laboratorium (team 3, Leverkankers en Tumorinvasie) in samenwerking met het Oncoprot-platform (UMS 005-TBMcore). Uitgaande van een formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefselmonster wordt een regio van belang geselecteerd en gelasermicrogedissecteerd. Vervolgens worden eiwitten geëxtraheerd, wordt de fixatie omgekeerd en worden eiwitten verteerd met trypsine. De resulterende peptiden worden vervolgens geanalyseerd door vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) op een hoge-resolutie massaspectrometer. Gegevensverwerking wordt uitgevoerd door een bio-informaticus: elk monster wordt vergeleken met een referentiemonster (bijvoorbeeld gezond leverweefsel), waardoor relatieve eiwitexpressie-intensiteiten (eiwitovervloedratio's) kunnen worden berekend. Twee monsters kunnen vervolgens worden vergeleken met behulp van een triangulatie-kwantificatiemethode, waarbij de eiwitovervloedratio's tussen de monsters worden vergeleken. Alle eiwitten die significant verschillende overvloedratio's vertonen tussen de twee monsters vormen het proteomische profiel.

Vooruitgang in op massaspectrometrie gebaseerde proteomische technologieën maakt nu hoogwaardige, gevoelige en kwantitatieve analyse van eiwitexpressieprofielen mogelijk uit kleine hoeveelheden weefsel, inclusief formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) monsters die routinematig worden verzameld tijdens diagnostische leverbiopten. Dit maakt retrospectieve analyses mogelijk van goed gekarakteriseerde patiëntcohorten en vergemakkelijkt de integratie van proteomische data met klinische uitkomsten.

Studieontwerp en Methodologie Deze studie is gebaseerd op de retrospectieve analyse van een cohort van n=30 patiënten van het Universitair Ziekenhuis Bordeaux (CHU), waarbij biologische monsters en klinische data reeds zijn verzameld als onderdeel van routinezorg. Aangezien de maligne transformatie van MASLD (Metabolic Associated Steatohepatitis) een lang proces is (meerdere jaren), zorgt deze retrospectieve benadering voor de haalbaarheid van de studie en de snelle verkrijging van resultaten.

Om de gestelde hypotheses aan te pakken, zal deze studie steunen op de retrospectieve analyse van klinische data van patiënten in het hepatologie-afdelingscohort bij CHU Bordeaux (geregistreerd onder ClinicalTrials.gov identifiers NCT01241227 en NCT02060565), evenals op proteomische analyse van leverbiopten van dezelfde patiënten, beschikbaar bij de CHU Bordeaux Cancer Biobank (CRB). Het Bordeaux CHU-cohort omvat momenteel meer dan 7000 MASLD-patiënten ingeschreven bij diagnose en tot op heden prospectief gevolgd. De eerste patiënt werd opgenomen in 2003, wat tot 20 jaar follow-up biedt voor vroege deelnemers, waardoor dit cohort een waardevolle bron is voor het bestuderen van het risico op maligne transformatie.

Klinische data zijn verzameld met een gestandaardiseerde procedure binnen een bestaande database, wat de data-kwaliteit en volledigheid voor dit project waarborgt. Proteomische data van leverbiopten van patiënten opgenomen in de ProteoMASH-studie zullen worden opgehaald uit een toegewijde database opgericht bij Inserm U1312 en gekruist met klinische data uit de CHU-database (zoals ontwikkeling van hepatocellulair carcinoom [HCC] tijdens follow-up, duur van follow-up sinds diagnose, aanwezigheid van diabetes, etc.), met als doel de diagnostische en prognostische waarde van deze nieuwe biologische markers te valideren.

Voor deze studie zullen we bioptfragmenten gebruiken verkregen tijdens routine klinische zorg. Klinische data zullen worden geëxtraheerd uit patiëntendossiers binnen de dienstendatabase; er zullen geen aanvullende procedures of follow-up bezoeken worden opgelegd aan patiënten, aangezien follow-up data worden verzameld als onderdeel van standaardzorg.

Patiënten uit het Bordeaux CHU-cohort zullen worden ingedeeld in twee subgroepen:

• Groep 1 (n=15): patiënten met een leverbiopt diagnostisch voor MASLD vóór HCC-ontwikkeling, met een tijdsinterval tussen biopt en HCC-diagnose variërend van 1 tot 15 jaar.
• Groep 2 (n=15): controlepatiënten met een leverbiopt diagnostisch voor MASLD die geen HCC ontwikkelden tijdens follow-up.

Potentiële vertekeningen inherent aan retrospectieve cohorten zullen zo effectief mogelijk worden gecontroleerd:

Controlepatiënten (Groep 2) zullen worden geselecteerd rekening houdend met bekende HCC-risicofactoren zoals leeftijd, geslacht, aanwezigheid en controle van diabetes (gedefinieerd door HbA1c <8% volgens Franse richtlijnen), en fibrose-stadium (histologisch gedefinieerd van F0: geen fibrose tot F4: cirrose). Het doel is om ervoor te zorgen dat deze risicofactoren gelijkmatig zijn verdeeld tussen de groepen.

Daarnaast zullen we ervoor zorgen dat Groep 2-patiënten ten minste 5 jaar zijn gevolgd met beeldvormende ondersteuning (echografie, CT-scan of MRI) om te bevestigen dat geen HCC gemist had kunnen worden.

Voor Groep 1 zullen objectieve diagnostische criteria voor HCC worden gebruikt, gebaseerd op beeldvorming (CT of MRI volgens LI-RADS-criteria van het American College of Radiology) of histopathologie (nieuw biopt of chirurgische resectie), om classificatiebias te minimaliseren. Bovendien, om de mogelijkheid van occult HCC op het moment van leverbiopt uit te sluiten, zullen alleen patiënten worden opgenomen bij wie HCC meer dan een jaar na het biopt werd gediagnosticeerd, met beeldvorming (echografie, CT of MRI) die de afwezigheid van HCC ten minste één jaar na het biopt en vóór HCC-diagnose bevestigt.

Een andere potentiële vertekening heeft betrekking op patiënten die uit follow-up zijn gevallen (bijvoorbeeld gevolgd in andere centra, overleden vóór 15 jaar zonder HCC-ontwikkeling), die zullen worden uitgesloten van analyse en mogelijk een ander HCC-risico hebben. Daarom kunnen we niet zeker zijn dat Groep 2-patiënten volledig alle MASLD-patiënten vertegenwoordigen die geen HCC ontwikkelen. Deze beperking is echter gerechtvaardigd door het verkennende karakter van de ProteoMASH-studie en zal worden overwogen in toekomstige projecten.

Bovendien zullen patiënten worden opgenomen over homogene tijdsperioden om verwarring door veranderingen in medisch management over tijd te vermijden.

Ten slotte zullen routinematig verzamelde klinische data die al beschikbaar zijn in de bestaande database (bijvoorbeeld HbA1c-waarden voor diabetescontrole, histologisch gedefinieerd fibrose-stadium) worden gebruikt om bias door ontbrekende data te minimaliseren.

Lever FFPE-biopsieën zullen geoptimaliseerde proteomische workflows ondergaan en de resulterende proteomische datasets zullen worden geanalyseerd met bio-informatica-pipelines om eiwitten of panels te identificeren die verschillend tot expressie komen tussen de HCC- en niet-HCC-groepen. Geïdentificeerde eiwitten zullen worden geannoteerd voor hun biologische functies, routes en betrokkenheid bij hepatocarcinogenese.

Klinische en Onderzoeksimplicaties De identificatie van robuuste proteomische biomarkers voor HCC-risico bij MASH-patiënten kan diepgaande klinische implicaties hebben. Het opnemen van dergelijke biomarkers in klinische workflows zou risicostratificatie-algoritmen kunnen verfijnen voorbij alleen fibrose-stadiëring, waardoor gepersonaliseerde surveillance-schema's op maat van individuele moleculaire risicoprofielen mogelijk worden.

Bovendien kunnen proteomische biomarkers dienen als therapeutische doelen of indicatoren van behandelingsrespons in opkomende farmacologische interventies voor MASH en vroeg HCC, wat precisiegeneeskunde-benaderingen vergemakkelijkt.

Toekomstige studies zouden zich moeten richten op het valideren van deze biomarkers in grotere, multicentrische cohorten en het integreren van proteomische data met andere omics-modaliteiten (genomica, metabolomica) en klinische parameters. Longitudinale bemonstering en seriële proteomische analyses zouden temporele dynamiek van ziekteprogressie en biomarkerfluctuaties kunnen ophelderen.

Conclusie Concluderend, de toepassing van weefselproteomica op FFPE-leverbioptmonsters van patiënten met metabool-geassocieerde steatohepatitis vertegenwoordigt een veelbelovende strategie voor het identificeren van nieuwe biomarkers voorspellend voor hepatocellulair carcinoom-risico. Deze benadering adresseert kritieke beperkingen van huidige diagnostische methoden en biedt een pad naar verbeterde vroege detectie, gepersonaliseerde risicobeoordeling en uiteindelijk betere patiëntuitkomsten in de groeiende populatie getroffen door MASH.