Langtidsprognose av MASH-relatert HCC-risiko ved proteomikk (PROTEOMASH)

Introduksjon MASH er en progressiv leversykdom, anerkjent som en alvorlig form for MASLD, karakterisert histologisk av hepatisk steatose ledsaget av hepatocellulær betennelse og ballooning-degenerasjon. Den representerer et økende folkehelseproblem på grunn av dens sterke sammenheng med komponenter av metabolsk syndrom som fedme, insulinresistens, type 2 diabetes mellitus, hypertensjon og dyslipidemi. Globalt er forekomsten av MASLD estimert til omtrent 25 %, med MASH som rammer en betydelig delgruppe av disse pasientene, spesielt de med samtidige metabolske lidelser.

MASH-progresjonen er heterogen og kan føre til avansert fibrose, cirrose og hepatocellulært karsinom (HCC). Viktig er det at mens cirrose er en velkjent risikofaktor for HCC, har nylige epidemiologiske og kliniske studier vist at HCC også kan utvikle seg i ikke-cirrotiske lever berørt av MASH. Dette fenomenet kompliserer klinisk beslutningstaking angående overvåking og behandling, ettersom nåværende retningslinjer primært anbefaler HCC-screening hos pasienter med cirrose uavhengig av etiologi.

Patogenesen til MASH og dens progresjon til HCC involverer komplekse interaksjoner mellom metabolske forstyrrelser, kronisk hepatisk betennelse, oksidativt stress, mitokondriell dysfunksjon, lipotoksisitet og aktivering av fibrogene veier. Overdreven akkumulering av frie fettsyrer og giftige lipidmetabolitter i hepatocytter induserer cellulært stress, som utløser inflammatoriske kaskader og apoptose. Kupffer-celler og rekrutterte immunceller opprettholder det inflammatoriske miljøet, og bidrar til progressiv fibrose.

Den økende forekomsten av MASH-relatert HCC understreger det presserende behovet for nye biomarkører som kan stratifisere pasienter nøyaktig i henhold til deres risiko for HCC-utvikling. Tidlig identifisering av høyt risikoutsatte individer vil muliggjøre tilpassede overvåkingsstrategier, tidlig diagnose og rettidige terapeutiske inngrep, noe som potensielt kan forbedre kliniske utfall. Dessverre har serologiske biomarkører, inkludert alfa-fetoprotein (AFP), begrenset sensitivitet og spesifisitet for tidlig HCC-deteksjon i MASH-populasjonen. Derfor undersøkes nye molekylære markører som reflekterer den underliggende patofysiologien til MASH og hepatokarsinogenese aktivt.

Proteomikk, den storskala studien av proteiner uttrykt av celler eller vev, tilbyr unike fordeler for biomarkøroppdagelse i MASH og HCC. Proteiner er de funksjonelle effektorene av cellulære prosesser og kan bedre reflektere dynamiske patologiske endringer sammenlignet med genomiske eller transkriptomiske data alene.

Vevproteomisk profilering ved massespektrometri er et innovativt og lovende verktøy som er godt egnet for identifikasjon av prognostiske proteomiske signaturer. Denne metodologien ble utviklet ved U1312 BRIC-laboratoriet (team 3, Leverkreft og tumorinvasion) i samarbeid med Oncoprot-plattformen (UMS 005-TBMcore). Utgangspunktet er en formalinfiksert, parafininnbakt (FFPE) vevsprøve, der et interesseområde blir valgt og lasermikrodissekert. Proteiner blir deretter ekstrahert, fikseringen reversert, og proteinene blir fordøyet ved bruk av trypsin. De resulterende peptidene analyseres deretter ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) på et høyoppløselig massespektrometer. Databehandling utføres av en bioinformatiker: hver prøve sammenlignes med en referanseprøve (f.eks. sunn levervev), noe som muliggjør beregning av relative proteinuttrykksintensiteter (proteinoverflødighetsforhold). To prøver kan deretter sammenlignes ved bruk av en trianguleringskvantifiseringsmetode, som innebærer å sammenligne proteinoverflødighetsforhold mellom prøvene. Alle proteiner som viser signifikant forskjellige overflødighetsforhold mellom de to prøvene utgjør proteomprofilen.

Fremskritt innen massespektrometribasert proteomisk teknologi muliggjør nå høyt gjennomløp, sensitiv og kvantitativ analyse av proteinuttrykksprofiler fra små mengder vev, inkludert formalinfiksert parafininnbakte (FFPE) prøver som rutinemessig samles inn under diagnostiske leverbiopsier. Dette muliggjør retrospektive analyser av velkarakteriserte pasientkohorter og letter integrering av proteomiske data med kliniske utfall.

Studiedesign og metodologi Denne studien er basert på den retrospektive analysen av en kohort på n=30 pasienter fra Bordeaux universitetssykehus (CHU), med biologiske prøver og kliniske data allerede samlet inn som del av rutinemessig omsorg. Siden den ondartede transformasjonen av MASLD (Metabolsk Assosiert Steatohepatitt) er en lang prosess (flere år), sikrer denne retrospektive tilnærmingen studiens gjennomførbarhet og rask innhenting av resultater.

For å adressere de oppgitte hypotesene, vil denne studien stole på den retrospektive analysen av kliniske data fra pasienter i hepatologiavdelingens kohort ved CHU Bordeaux (registrert under ClinicalTrials.gov identifikatorer NCT01241227 og NCT02060565), samt på proteomisk analyse av leverbiopsier fra de samme pasientene, tilgjengelig ved CHU Bordeaux Cancer Biobank (CRB). Bordeaux CHU-kohorten inkluderer for tiden over 7000 MASLD-pasienter inkludert ved diagnose og fulgt prospektivt til dags dato. Den første pasienten ble inkludert i 2003, noe som gir opptil 20 års oppfølging for tidlige deltakere, noe som gjør denne kohorten til en verdifull ressurs for å studere risikoen for ondartet transformasjon.

Kliniske data er samlet inn ved bruk av en standardisert prosedyre innenfor en eksisterende database, noe som sikrer datakvalitet og fullstendighet for dette prosjektet. Proteomiske data fra leverbiopsier av pasienter inkludert i ProteoMASH-studien vil bli hentet fra en dedikert database etablert ved Inserm U1312 og kryssreferert med kliniske data fra CHU-databasen (som utvikling av hepatocellulært karsinom [HCC] under oppfølging, varighet av oppfølging siden diagnose, tilstedeværelse av diabetes, etc.), med mål om å validere den diagnostiske og prognostiske verdien av disse nye biologiske markørene.

For denne studien vil vi bruke biopsifragmenter oppnådd under rutinemessig klinisk omsorg. Kliniske data vil bli ekstrahert fra pasientens medisinske journaler innenfor tjenestedatabasen; ingen ytterligere prosedyrer eller oppfølgingsbesøk vil bli pålagt pasientene, ettersom oppfølgingsdata samles inn som del av standard omsorg.

Pasienter fra Bordeaux CHU-kohorten vil bli klassifisert i to undergrupper:

• Gruppe 1 (n=15): pasienter med en leverbiopsi diagnostisk for MASLD før HCC-utvikling, med et tidsintervall mellom biopsi og HCC-diagnose som varierer fra 1 til 15 år.
• Gruppe 2 (n=15): kontrollpasienter med en leverbiopsi diagnostisk for MASLD som ikke utviklet HCC under oppfølging.

Potensielle bias iboende i retrospektive kohorter vil bli kontrollert så effektivt som mulig:

Kontrollpasienter (Gruppe 2) vil bli valgt med hensyn til kjente HCC-risikofaktorer som alder, kjønn, tilstedeværelse og kontroll av diabetes (definert av HbA1c <8 % i henhold til franske retningslinjer), og fibrosestadium (histologisk definert fra F0: ingen fibrose til F4: cirrose). Målet er å sikre at disse risikofaktorene er likt fordelt mellom gruppene.

I tillegg vil vi sikre at Gruppe 2-pasienter har blitt fulgt i minst 5 år med bildeunderstøttelse (ultralyd, CT-scanning eller MRI) for å bekrefte at ingen HCC kunne ha blitt oversett.

For Gruppe 1 vil objektive diagnostiske kriterier for HCC bli brukt, basert på bilde (CT eller MRI følger LI-RADS-kriterier fra American College of Radiology) eller histopatologi (ny biopsi eller kirurgisk reseksjon), for å minimere klassifiseringsbias. Videre, for å ekskludere muligheten for okkult HCC på tidspunktet for leverbiopsi, vil kun pasienter med HCC diagnostisert mer enn ett år etter biopsi bli inkludert, med bilde (ultralyd, CT eller MRI) som bekrefter fravær av HCC minst ett år etter biopsi og før HCC-diagnose.

En annen potensiell bias relaterer seg til pasienter tapt til oppfølging (f.eks. fulgt ved andre sentre, døde før 15 år uten HCC-utvikling), som vil bli ekskludert fra analyse og kan ha forskjellig HCC-risiko. Derfor kan vi ikke være sikre på at Gruppe 2-pasienter fullt ut representerer alle MASLD-pasienter som ikke utvikler HCC. Denne begrensningen er imidlertid begrunnet av den utforskende naturen til ProteoMASH-studien og vil bli vurdert i fremtidige prosjekter.

Videre vil pasienter bli inkludert over homogene tidsperioder for å unngå forvirring på grunn av endringer i medisinsk behandling over tid.

Til slutt vil rutinemessig innsamlede kliniske data allerede tilgjengelig i den eksisterende databasen (f.eks. HbA1c-verdier for diabeteskontroll, histologisk definert fibrosestadium) bli brukt for å minimere manglende databias.

Lever FFPE-biopsier vil gjennomgå optimerte proteomiske arbeidsflyter og de resulterende proteomiske datasettene vil bli analysert ved bruk av bioinformatiske pipelines for å identifisere proteiner eller panel som er differensielt uttrykt mellom HCC- og ikke-HCC-gruppene. Identifiserte proteiner vil bli annotert for deres biologiske funksjoner, veier og involvering i hepatokarsinogenese.

Kliniske og forskningsimplikasjoner Identifikasjonen av robuste proteomiske biomarkører for HCC-risiko hos MASH-pasienter kan ha dype kliniske implikasjoner. Inkorporering av slike biomarkører i kliniske arbeidsflyter kunne forbedre risikostratifiseringsalgoritmer utover fibrosestadiering alene, og muliggjøre personlige overvåkingsplaner skreddersydd til individuelle molekylære risikoprofiler.

Videre kan proteomiske biomarkører tjene som terapeutiske mål eller indikatorer på behandlingsrespons i nye farmakologiske inngrep for MASH og tidlig HCC, noe som letter presisjonsmedisinske tilnærminger.

Fremtidige studier bør fokusere på å validere disse biomarkørene i større, multisentriske kohorter og integrere proteomiske data med andre omik-modaliteter (genomikk, metabolomikk) og kliniske parametere. Longitudinal prøvetaking og serielle proteomiske analyser kunne belyse temporale dynamikker av sykdomsprogresjon og biomarkørfluktuasjoner.

Konklusjon Avslutningsvis representerer anvendelsen av vevsproteomikk på FFPE leverbiopsiprøver fra pasienter med metabolsk-assosiert steatohepatitt en lovende strategi for å identifisere nye biomarkører prediktive for hepatocellulært karsinomrisiko. Denne tilnærmingen adresserer kritiske begrensninger av nåværende diagnostiske metoder og tilbyr en vei mot forbedret tidlig deteksjon, personlig risikovurdering, og til slutt bedre pasientutfall i den voksende populasjonen berørt av MASH.