Langtidsforudsigelse af MASH-relateret HCC-risiko ved proteomik (PROTEOMASH)

Introduktion MASH er en progressiv leversygdom, der anerkendes som en alvorlig form for MASLD, karakteriseret histologisk ved hepatisk steatose ledsaget af hepatocellulær inflammation og ballooning degeneration. Den udgør en voksende folkesundhedsbekymring på grund af dens stærke sammenhæng med komponenter af metabolisk syndrom såsom fedme, insulinresistens, type 2-diabetes, hypertension og dyslipidæmi. Globalt estimeres prævalensen af MASLD at være ca. 25%, hvor MASH rammer en betydelig del af disse patienter, især dem med komorbide metaboliske lidelser.

MASH-progressionen er heterogen og kan føre til avanceret fibrose, cirrose og hepatocellulært karcinom (HCC). Vigtigt er det, at mens cirrose er en velkendt risikofaktor for HCC, har nyere epidemiologiske og kliniske undersøgelser vist, at HCC også kan udvikle sig i ikke-cirrotiske lever påvirket af MASH. Dette fænomen komplicerer klinisk beslutningstagning vedrørende overvågning og behandling, da nuværende retningslinjer primært anbefaler HCC-screening hos patienter med cirrose uanset ætiologi.

Patogenesen af MASH og dens progression til HCC involverer komplekse interaktioner mellem metaboliske forstyrrelser, kronisk hepatisk inflammation, oxidativ stress, mitokondriel dysfunktion, lipotoksicitet og aktivering af fibrogene signalveje. Overdreven akkumulation af frie fedtsyrer og toksiske lipidmetabolitter i hepatocytter inducerer cellulær stress, hvilket udløser inflammatoriske kaskader og apoptose. Kupffer-celler og rekrutterede immunceller opretholder det inflammatoriske miljø og bidrager til progressiv fibrose.

Den stigende incidens af MASH-relateret HCC understreger det presserende behov for nye biomarkører, der kan stratificere patienter præcist efter deres risiko for HCC-udvikling. Tidlig identifikation af højrisikoindivider ville muliggøre skræddersyede overvågningsstrategier, tidlig diagnose og rettidige terapeutiske interventioner, hvilket potentielt kan forbedre de kliniske resultater. Desværre har serologiske biomarkører, inklusive alfa-fetoprotein (AFP), begrænset sensitivitet og specificitet for tidlig HCC-detektion i MASH-populationen. Derfor undersøges nye molekylære markører, der afspejler den underliggende patofysiologi af MASH og hepatokarcinogenese, aktivt.

Proteomik, den storskala undersøgelse af proteiner udtrykt af celler eller væv, tilbyder unikke fordele for biomarkør-opdagelse i MASH og HCC. Proteiner er de funktionelle effektorer af cellulære processer og kan bedre afspejle dynamiske patologiske forandringer sammenlignet med kun genomiske eller transkriptomiske data.

Vævsproteomisk profilering ved massespektrometri er et innovativt og lovende værktøj, der er velegnet til identifikation af prognostiske proteomiske signaturer. Denne metodologi blev udviklet på U1312 BRIC-laboratoriet (team 3, Levercancer og tumorinvasion) i samarbejde med Oncoprot-platformen (UMS 005-TBMcore). Ud fra en formalinfikseret, parafinindlejret (FFPE) vævsprøve udvælges et interessandområde og laser-mikrodissekteres. Proteiner ekstraheres derefter, fikseringen reverseres, og proteinerne nedbrydes med trypsin. De resulterende peptider analyseres efterfølgende ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) på et højopløseligt massespektrometer. Databehandling udføres af en bioinformatiker: hver prøve sammenlignes med en referenceprøve (f.eks. sundt levervæv), hvilket muliggør beregning af relative proteinudtryksintensiteter (proteinoverflodskvoter). To prøver kan derefter sammenlignes ved hjælp af en trianguleringskvantificeringsmetode, der involverer sammenligning af proteinoverflodskvoter mellem prøverne. Alle proteiner, der udviser signifikant forskellige overflodskvoter mellem de to prøver, udgør den proteomiske profil.

Fremskridt inden for massespektrometribaseret proteomisk teknologi muliggør nu højtydelses-, følsom og kvantitativ analyse af proteinudtryksprofiler fra små mængder væv, inklusive formalinfikserede parafinindlejrede (FFPE) prøver, der rutinemæssigt indsamles under diagnostiske leverbiopsier. Dette muliggør retrospektive analyser af velkarakteriserede patientkohorter og letter integration af proteomiske data med kliniske resultater.

Studiedesign og metodologi Dette studie er baseret på den retrospektive analyse af en kohorte på n=30 patienter fra Bordeaux Universitetshospital (CHU), med biologiske prøver og kliniske data allerede indsamlet som en del af rutinemæssig pleje. Da den maligne transformation af MASLD (Metabolisk associeret steatohepatitis) er en lang proces (flere år), sikrer denne retrospektive tilgang studiet's gennemførlighed og den hurtige indhentning af resultater.

For at adressere de angivne hypoteser vil dette studie stole på den retrospektive analyse af kliniske data fra patienter i hepatologiafdelingens kohorte på CHU Bordeaux (registreret under ClinicalTrials.gov identifikatorer NCT01241227 og NCT02060565), samt på proteomisk analyse af leverbiopsier fra de samme patienter, tilgængelige på CHU Bordeaux Cancer Biobank (CRB). Bordeaux CHU-kohorten inkluderer i øjeblikket over 7000 MASLD-patienter indskrevet ved diagnose og fulgt prospektivt til dags dato. Den første patient blev inkluderet i 2003, hvilket giver op til 20 års opfølgning for tidlige deltagere, hvilket gør denne kohorte til en værdifuld ressource til at studere risikoen for malign transformation.

Kliniske data er indsamlet ved hjælp af en standardiseret procedure i en eksisterende database, hvilket sikrer datakvalitet og fuldstændighed for dette projekt. Proteomiske data fra leverbiopsier af patienter inkluderet i ProteoMASH-studiet vil blive hentet fra en dedikeret database etableret på Inserm U1312 og krydsrefereret med kliniske data fra CHU-databasen (såsom udvikling af hepatocellulært karcinom [HCC] under opfølgning, varighed af opfølgning siden diagnose, tilstedeværelse af diabetes osv.), med det formål at validere den diagnostiske og prognostiske værdi af disse nye biologiske markører.

Til dette studie vil vi bruge biopsifragmenter opnået under rutinemæssig klinisk pleje. Kliniske data vil blive ekstraheret fra patientjournaler i tjenestedatabasen; ingen yderligere procedurer eller opfølgningsbesøg vil blive pålagt patienter, da opfølgningsdata indsamles som en del af standardplejen.

Patienter fra Bordeaux CHU-kohorten vil blive klassificeret i to undergrupper:

• Gruppe 1 (n=15): patienter med en leverbiopsi diagnostisk for MASLD før HCC-udvikling, med et tidsinterval mellem biopsi og HCC-diagnose på mellem 1 og 15 år.
• Gruppe 2 (n=15): kontrolpatienter med en leverbiopsi diagnostisk for MASLD, som ikke udviklede HCC under opfølgningen.

Potentielle bias iboende til retrospektive kohorter vil blive kontrolleret så effektivt som muligt:

Kontrolpatienter (Gruppe 2) vil blive udvalgt under hensyntagen til kendte HCC-risikofaktorer såsom alder, køn, tilstedeværelse og kontrol af diabetes (defineret ved HbA1c <8% ifølge franske retningslinjer) og fibrosestadie (histologisk defineret fra F0: ingen fibrose til F4: cirrose). Målet er at sikre, at disse risikofaktorer er tilsvarende fordelt mellem grupperne.

Derudover vil vi sikre, at Gruppe 2-patienter er blevet fulgt i mindst 5 år med billeddannende støtte (ultralyd, CT-scanning eller MR-scanning) for at bekræfte, at intet HCC kunne være blevet overset.

For Gruppe 1 vil objektive diagnostiske kriterier for HCC blive brugt, baseret på billeddannelse (CT eller MR-scanning efter LI-RADS-kriterier fra American College of Radiology) eller histopatologi (ny biopsi eller kirurgisk resektion), for at minimere klassifikationsbias. Yderligere, for at udelukke muligheden for okkult HCC på tidspunktet for leverbiopsi, vil kun patienter med HCC diagnosticeret mere end et år efter biopsi blive inkluderet, med billeddannelse (ultralyd, CT eller MR-scanning) der bekræfter fravær af HCC mindst et år efter biopsi og før HCC-diagnose.

En anden potentiel bias relaterer sig til patienter tabt til opfølgning (f.eks. fulgt på andre centre, døde før 15 år uden HCC-udvikling), som vil blive udelukket fra analyse og muligvis har forskellig HCC-risiko. Derfor kan vi ikke være sikre på, at Gruppe 2-patienter fuldt ud repræsenterer alle MASLD-patienter, der ikke udvikler HCC. Denne begrænsning er dog berettiget af ProteoMASH-studiets eksplorative karakter og vil blive overvejet i fremtidige projekter.

Desuden vil patienter blive inkluderet over homogene tidsperioder for at undgå forvirring på grund af ændringer i medicinsk behandling over tid.

Endelig vil rutinemæssigt indsamlede kliniske data allerede tilgængelige i den eksisterende database (f.eks. HbA1c-værdier for diabeteskontrol, histologisk defineret fibrosestadie) blive brugt til at minimere bias fra manglende data.

Lever-FFPE-biopsier vil gennemgå optimerede proteomiske arbejdsgange, og de resulterende proteomiske datasæt vil blive analyseret ved hjælp af bioinformatikpipeliner for at identificere proteiner eller paneler differentielt udtrykt mellem HCC- og ikke-HCC-grupperne. Identificerede proteiner vil blive annoteret for deres biologiske funktioner, signalveje og involvering i hepatokarcinogenese.

Kliniske og forskningsmæssige implikationer Identifikationen af robuste proteomiske biomarkører for HCC-risiko hos MASH-patienter kan have dybtgående kliniske implikationer. Inkorporering af sådanne biomarkører i kliniske arbejdsgange kunne forfine risikostratificeringsalgoritmer ud over kun fibrosestadiering, hvilket muliggør personlige overvågningsplaner skræddersyet til individuelle molekylære risikoprofiler.

Desuden kan proteomiske biomarkører tjene som terapeutiske mål eller indikatorer for behandlingsrespons i nye farmakologiske interventioner for MASH og tidligt HCC, hvilket letter præcisionsmedicinske tilgange.

Fremtidige studier bør fokusere på at validere disse biomarkører i større, multicentriske kohorter og integrere proteomiske data med andre omics-modaliteter (genomik, metabolomik) og kliniske parametre. Longitudinal prøveudtagning og seriel proteomisk analyse kunne belyse tidsmæssig dynamik af sygdomsprogression og biomarkørfluktuationer.

Konklusion Samlet set repræsenterer anvendelsen af vævsproteomik på FFPE-leverbiopsiprøver fra patienter med metabolisk associeret steatohepatitis en lovende strategi til at identificere nye biomarkører, der forudsiger risiko for hepatocellulært karcinom. Denne tilgang adresserer kritiske begrænsninger i nuværende diagnostiske metoder og tilbyder en vej mod forbedret tidlig detektion, personlig risikovurdering og i sidste ende bedre patientresultater i den voksende befolkning påvirket af MASH.