希少疾患の診断のためのロングリードシーケンシングの実装。 (LongEpi)

第3次希少疾患国家計画（PNMR3）に続き、PNMR4の主な目的は、診断の不確実性と行き詰まりを減らし、希少疾患分野における診断と新規治療法の開発を促進するためのトランスレーショナルリサーチを強化することです。

この目的のため、フランスゲノム医療計画2025（PFMG2025）は、診断目的の全ゲノムシーケンシング（WGS）の展開を組織しています。

この技術的マイルストーンは、コーディング領域外の領域をカバーし、最近ではRNU4-2遺伝子の変異が知的発達障害（IDD）の主要な原因であることを特定し、症例の約0.4％を占めています。 RNU4-2は、タンパク質に翻訳されない小さな核内RNA（snRNA）をコードする遺伝子であり、その変異はエクソームシーケンシング技術ではアクセスできません。

しかし、現在の知見に基づくと、これらの技術はショートリードシーケンシング技術に基づいており、患者の最大50％まで診断できます。 したがって、これらの技術では特定されない変異を検出するための新しい技術を開発する必要があります。

この文脈において、特にナノポア技術を用いた第三世代シーケンシングの開発により、ネイティブDNA上のメチル化シトシンの検出と組み合わせたロングリード全ゲノムシーケンシングを通じて、ゲノムおよびポストゲノムアプローチを組み合わせることが可能になりました。

この新しいアプローチにより、点変異または構造的ゲノム変異、メチル化異常、ハプロタイプ再構築の同時検出が可能になります。 多くの研究が、この戦略が希少疾患の診断率を向上させ、第一選択の遺伝子検査となる可能性があることを示しています。

DNAメチル化は、ゲノム配列の変化を引き起こさないエピジェネティック修飾ですが、遺伝子の転写（RNA合成）を調節し、したがってその発現を調節します。 メチル化研究は、エピシグネチャーを確立するため、またはメチル化異常を探すために行われます。 エピシグネチャーは、メチル化マークを調節することが知られている遺伝子の変異の結果です。

メチル化異常は、プラダー・ウィリ／アンジェルマン症候群やベックウィズ・ヴィーデマン／シルバー・ラッセル症候群などの特定の疾患に対する標的分析ですでに知られ、求められています。 他の疾患の診断に対するメチル化分析の貢献は最近実証されました。 例えば、常染色体劣性遺伝子MMACHCに関連するメチルマロン酸血症およびホモシスチン尿症タイプcblCでは、プロモーターのメチル化分析により、PRDX1遺伝子のイントロン変異の存在に関連する過剰メチル化が明らかになりました。 このイントロン変異は、MMACHC遺伝子のプロモーターと重複する異常なアンチセンスRNAの合成を引き起こし、その過剰メチル化を引き起こします。 2024年には、毛孔角化症患者における全ゲノムおよびメチル化の組み合わせ分析により、FDFT1遺伝子が発見されました。 一般的に、メチル化プロファイルの研究は、ゲノム分析後に診断されていない希少疾患患者の診断の不確実性を減らすことの価値を示しています。

希少疾患の分子診断の文脈におけるパンゲノムレベルでのメチル化異常（またはエピ変異）の探索は、依然としてほとんどアクセスできず、文献でも十分に記述されていません。 それらの検出に日常的に使用される技術は、ほとんどの場合、亜硫酸処理とPCR増幅に基づいています。 亜硫酸処理の欠点は、DNAを分解してロングリードアプリケーションを妨げること、5mCと5hmCメチル化を区別しないこと、および非メチル化シトシンが処理されないと偽陽性を引き起こす可能性があることです。 さらに、ショートリードで特定されたゲノム変異との位相決定には、SNPアレイなどの補完的技術が必要です。

したがって、このアプローチは、希少疾患における診断の不確実性との闘いにおける主要な技術的進歩であり、患者のための精密医療への移行の一部をなしています。

ボルドー大学病院における南西オクシタニー・レユニオン発達異常および奇形症候群参照センター（CRMR ADSOOR）の一環として、私たちは、特に知的発達障害を伴う発達異常（特にクロマチノパシー、ルビンシュタイン・テイビ症候群、およびアルビニズム）の分野において、臨床および分子専門知識を開発してきました。

2024年には、CRMRで2,300件の相談が行われました。 さらに、私たちの分子生物学研究所で、アルビニズムおよび知的発達障害と奇形症候群のために、それぞれ243件および228件のゲノムまたはエクソーム分析が解釈されました。

したがって、これら2つの分野における私たちの専門知識は、ボルドー大学病院におけるこの革新的アプローチを用いたこのパイロットプロジェクトの開発のための最良の出発点を表しています。