Implementazione del sequenziamento a lettura lunga per la diagnosi di malattie rare. (LongEpi)

In seguito al terzo piano nazionale per le malattie rare (PNMR3), i principali obiettivi del PNMR4 sono ridurre l'incertezza diagnostica e i vicoli ciechi e rafforzare la ricerca traslazionale per promuovere la diagnosi e lo sviluppo di nuovi trattamenti nel campo delle malattie rare.

A tal fine, il Piano Francese di Medicina Genomica 2025 (PFMG2025) sta organizzando l'implementazione del sequenziamento dell'intero genoma (WGS) a fini diagnostici.

Questa pietra miliare tecnologica, che copre regioni al di fuori delle regioni codificanti, ha recentemente permesso di identificare le variazioni nel gene RNU4-2 come una causa principale del Disturbo dello Sviluppo Intellettivo (IDD), rappresentando circa lo 0,4% dei casi. RNU4-2 è un gene che codifica un piccolo RNA nucleare (snRNA), che non viene tradotto in proteina, e le cui variazioni non sono accessibili alle tecniche di sequenziamento dell'esoma.

Tuttavia, in base alle conoscenze attuali, queste tecniche si basano sulla tecnologia di sequenziamento a lettura breve e possono diagnosticare fino al 50% dei pazienti. È quindi necessario sviluppare nuove tecniche per rilevare le variazioni non identificate da queste tecniche.

In questo contesto, lo sviluppo del sequenziamento di terza generazione, in particolare utilizzando la tecnologia Nanopore, ora permette di combinare approcci genomici e post-genomici attraverso il sequenziamento dell'intero genoma a lettura lunga accoppiato con il rilevamento delle citosine metilate sul DNA nativo.

Questo nuovo approccio permette quindi il rilevamento simultaneo di varianti genomiche puntiformi o strutturali, anomalie di metilazione e la ricostruzione dell'aplotipo. Numerosi studi hanno dimostrato che questa strategia migliora il tasso di diagnosi delle malattie rare e potrebbe diventare un test genetico di prima linea.

La metilazione del DNA è una modificazione epigenetica che non causa cambiamenti nella sequenza genomica ma regola la trascrizione (sintesi dell'RNA) dei geni e quindi la loro espressione. Gli studi di metilazione vengono eseguiti sia per stabilire un'epifirma che per cercare anomalie di metilazione. Un'epifirma è il risultato di una variazione in un gene noto per regolare i segni di metilazione.

Le anomalie di metilazione sono già note e ricercate nell'analisi mirata per alcune malattie come le sindromi di Prader-Willi/Angelman e le sindromi di Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. Il contributo dell'analisi della metilazione alla diagnosi di altre malattie è stato recentemente dimostrato. Ad esempio, nell'aciduria metilmalonica e omocistinuria tipo cblC associata al gene autosomico recessivo MMACHC, l'analisi della metilazione del promotore ha rivelato una ipermetilazione legata alla presenza di una variante intronica del gene PRDX1. Questa variante intronica porta alla sintesi di un RNA antisenso aberrante che si sovrappone al promotore del gene MMACHC, causandone l'ipermetilazione. Nel 2024, l'analisi combinata dell'intero genoma e della metilazione in pazienti con porocheratosi ha portato alla scoperta del gene FDFT1. In generale, lo studio dei profili di metilazione ha dimostrato il suo valore nel ridurre l'incertezza diagnostica in pazienti con malattie rare non diagnosticati dopo l'analisi del genoma.

La ricerca di anomalie di metilazione (o epimutazione) a livello pan-genomico nel contesto della diagnosi molecolare delle malattie rare rimane in gran parte inaccessibile e poco descritta in letteratura. Le tecniche comunemente utilizzate per il loro rilevamento si basano più spesso sul trattamento con bisolfito e l'amplificazione PCR. Gli svantaggi del trattamento con bisolfito sono che degrada il DNA, impedendo applicazioni a lettura lunga, che non distingue tra metilazione 5mC e 5hmC, e che il mancato trattamento delle citosine non metilate può portare a falsi positivi. Inoltre, la determinazione della fase con una variante genomica identificata in letture brevi richiede tecniche complementari come gli array SNP.

Questo approccio appare quindi come un importante progresso tecnologico nella lotta contro l'incertezza diagnostica nelle malattie rare e si inserisce nel percorso verso la medicina di precisione per i pazienti.

Nell'ambito del nostro Centro di Riferimento per le Anomalie dello Sviluppo e le Sindromi Malformative del Sud-Ovest Occitania Riunione (CRMR ADSOOR) presso l'Ospedale Universitario di Bordeaux, abbiamo sviluppato competenze cliniche e molecolari, in particolare nel campo delle anomalie dello sviluppo con disturbi dello sviluppo intellettivo (soprattutto cromatinopatie e sindrome di Rubinstein Taybi e albinismo.

Nel 2024, sono state effettuate 2.300 consultazioni presso il CRMR. Inoltre, 243 e 228 analisi del genoma o dell'esoma sono state interpretate nel nostro laboratorio di biologia molecolare rispettivamente per albinismo e disturbo dello sviluppo intellettivo e sindrome malformativa.

La nostra competenza in queste due aree rappresenta quindi il miglior punto di partenza per lo sviluppo di questo progetto pilota utilizzando questo approccio innovativo presso l'Ospedale Universitario di Bordeaux.