Implementace dlouhého čtení sekvenování pro diagnostiku vzácných onemocnění. (LongEpi)

V návaznosti na třetí národní plán pro vzácná onemocnění (PNMR3) jsou hlavními cíli PNMR4 snížení diagnostické nejistoty a slepých uliček a posílení translakčního výzkumu za účelem podpory diagnostiky a vývoje nových léčebných postupů v oblasti vzácných onemocnění.

Za tímto účelem organizuje Francouzský plán genomické medicíny 2025 (PFMG2025) zavádění sekvenování celého genomu (WGS) pro diagnostické účely.

Tento technologický milník, který pokrývá oblasti mimo kódující oblasti, nedávno umožnil identifikaci variací v genu RNU4-2 jako hlavní příčiny poruchy intelektuálního vývoje (IDD), která představuje přibližně 0,4 % případů. RNU4-2 je gen kódující malou jadernou RNA (snRNA), která není přeložena do proteinu a jejíž variace nejsou dostupné technikám sekvenování exomu.

Na základě současných znalostí jsou však tyto techniky založeny na technologii sekvenování krátkých čtení a mohou diagnostikovat až 50 % pacientů. Je tedy nutné vyvinout nové techniky pro detekci variací, které tyto techniky neidentifikují.

V tomto kontextu rozvoj sekvenování třetí generace, zejména pomocí technologie Nanopore, nyní umožňuje kombinovat genomické a postgenomické přístupy prostřednictvím dlouhého čtení celého genomu spojeného s detekcí methylovaných cytosinů na nativní DNA.

Tento nový přístup tedy umožňuje současnou detekci bodových nebo strukturních genomických variant, abnormalit methylace a rekonstrukci haplotypů. Četné studie ukázaly, že tato strategie zlepšuje míru diagnostiky vzácných onemocnění a mohla by se stát prvotním genetickým testem.

Methylace DNA je epigenetická modifikace, která nezpůsobuje změny v genomové sekvenci, ale reguluje transkripci (syntézu RNA) genů a tedy jejich expresi. Studie methylace se provádějí buď za účelem stanovení episignatury, nebo za účelem hledání abnormalit methylace. Episignatura je výsledkem variace v genu, o kterém je známo, že reguluje methylační značky.

Abnormality methylace jsou již známé a vyhledávané při cílené analýze u některých onemocnění, jako jsou syndromy Prader-Willi/Angelman a syndromy Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell. Příspěvek analýzy methylace k diagnostice dalších onemocnění byl nedávno prokázán. Například u methylmalonové acidurie a homocystinurie typu cblC spojené s autosomálně recesivním genem MMACHC odhalila analýza methylace promotoru hypermethylaci spojenou s přítomností intronové varianty genu PRDX1. Tato intronová varianta vede k syntéze aberantní antisense RNA překrývající promotor genu MMACHC, což způsobuje jeho hypermethylaci. V roce 2024 vedla kombinovaná analýza celého genomu a methylace u pacientů s porokeratózou k objevu genu FDFT1. Obecně studie methylačních profilů prokázala svou hodnotu při snižování diagnostické nejistoty u pacientů se vzácnými onemocněními, kteří nebyli diagnostikováni po genomové analýze.

Hledání abnormalit methylace (nebo epimutace) na pangenomové úrovni v kontextu molekulární diagnostiky vzácných onemocnění zůstává z velké části nedostupné a v literatuře je málo popsáno. Techniky rutinně používané pro jejich detekci jsou nejčastěji založeny na bisulfitové úpravě a PCR amplifikaci. Nevýhody bisulfitové úpravy spočívají v tom, že degraduje DNA, čímž brání aplikacím dlouhého čtení, že nerozlišuje mezi methylací 5mC a 5hmC a že selhání úpravy nemethylovaných cytosinů může vést k falešně pozitivním výsledkům. Kromě toho určení fáze s genomickou variantou identifikovanou v krátkých čteních vyžaduje doplňkové techniky, jako jsou SNP pole.

Tento přístup se tedy jeví jako významný technologický pokrok v boji proti diagnostické nejistotě u vzácných onemocnění a je součástí postupu směrem k precizní medicíně pro pacienty.

V rámci našeho Referenčního centra pro vývojové anomálie a malformační syndromy jihozápadní Occitanie Réunion (CRMR ADSOOR) v Univerzitní nemocnici Bordeaux jsme vyvinuli klinickou a molekulární expertizu, zejména v oblasti vývojových anomálií s poruchami intelektuálního vývoje (zejména chromatinopatie a Rubinstein-Taybiho syndrom a albinismus).

V roce 2024 bylo v CRMR provedeno 2 300 konzultací. Kromě toho bylo v naší laboratoři molekulární biologie interpretováno 243 a 228 analýz genomu nebo exomu pro albinismus a poruchu intelektuálního vývoje a malformační syndrom.

Naše expertiza v těchto dvou oblastech tedy představuje nejlepší výchozí bod pro rozvoj tohoto pilotního projektu využívajícího tento inovativní přístup v Univerzitní nemocnici Bordeaux.